생체 내 FPOP 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 구조 C-elegans에 변화. 이 동물은 인간 적인 질병을 공부하기 위하여 모형 시스템으로 널리 이용됩니다. 생체 내 FPOP을 대량 분광법에 결합함으로써, 우리는 특정 단백질을 분리할 필요 없이 살아있는 동물에서 다른 세포 및 바디 구획 내에서 단백질 단백질 상호 작용을 조사할 수 있습니다.
플루오라이트 에틸렌 프로필렌 또는 FPP 튜빙의 2센티미터 조각을 절단하여 흐름 시스템 조립을 시작합니다. 깨끗한 해부 바늘을 사용하여 튜브의 한쪽 끝에서 내름을 넓히면 길이가 약 15밀리미터에 달하는 작은 분화구를 만듭니다. 유동 시스템의 주입 라인을 만들려면 250 마이크로미터 의 15센티미터 조각으로 잘라 세라믹 커터와 실리카를 융합시다.
그리고 두 모세 혈관을 자체 접착제 테이프와 함께 테이프로 붙이면 끝이 100 % 플러시되었는지 확인합니다. FPP 튜빙의 분화구에 두 개의 모세혈관을 삽입하여 가장자리까지 밀어 넣습니다. 깨끗한 표면에 에폭시 수지의 작은 점을 놓고 해부 바늘과 섞습니다.
같은 바늘을 사용하여 수지의 작은 방울을 빠르게 놓고 FPP 튜브와 연결하는 주입 모세 혈관끝에 수지가 몇 분 동안 콘센트 측면을 건조시킬 수 있습니다. 한편, 새로운 250 마이크로미터 의 내지름 모세관을 잘라 유동 시스템의 출구 모세관이 될 것입니다. 수지가 건조되면 새로운 모세관을 FPP 튜브 콘센트 끝에 삽입하십시오.
출구 모세관의 내부 끝과 두 개의 주입 모세 혈관은 혼합 차를 생성, 서로에 대해 플러시해야합니다. 모세관 및 FPP 튜빙에 이전에 설명한 대로 신선한 에폭시 수지와 결합하고 유동 시스템이 밤새 건조되도록 합니다. 4개의 자기 교반기를 삽입하고, 5밀리리터 주사기 1개 안에 이 주사기에 벌레가 단백질의 빠른 광화학적 산화 또는 생체 내 FPOP에서 침전되는 것을 방지할 수 있습니다.
이 것과 M9로 5밀리리터 주사기를 추가로 채우고 거품을 일으키지 않도록 하십시오. 낮은 어댑터를 각 주사기에 연결하여 손가락이 단단하고 제자리에 고정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 각 주사기를 단일 3-2 밸브의 중간 포트에 부착합니다.
각 주사기를 듀얼 주사기 펌프에 고정하고 기계색을 조절하여 푸셔 블록의 과압을 방지합니다. FEP 슬리브와 슈퍼 플랜지 리스트 변수가 아닌 슈퍼 플랜지 리스트를 사용하여 이전에 만들어진 미세 유체 시스템의 모세관 끝을 각 3-2 밸브의 상단 포트에 부착합니다. 마지막으로, 10센티미터 450 마이크로미터 의 내경 모세관을 밸브의 하단 포트에 부착하여 시료 모세관을 철회하는 역할을 합니다.
펌프 흐름을 시작하고 누출에 대한 모든 연결을 시각적으로 검사합니다. 실험 유량을 사용하여 적어도 3개의 주사기 부피를 유량한다. 흐름 경로는 3-2 밸브 핸들의 화살표로 표시되며 각 주사기는 밸브 핸들을 추방에서 철수 위치로 이동하여 수동으로 다시 채울 수 있습니다.
미세 유체 흐름 시스템을 검사한 후 실험용 벤치로 이동하여 스테인레스 스틸 조합으로 배출 단계로 출구 모세관을 고정합니다. 레이저 조사 창에서 융합 된 실리카의 코팅을 태우고 보풀 조직과 메탄올로 연소 된 코팅을 청소하는 데 긴 도달 라이터를 사용합니다. 마그네틱 교반기 블록을 주사기 위에 자석 교반하여 저음으로 배치하고 속도를 조절하여 교반이 천천히 끊임없이 회전되도록 합니다.
크립톤 불소 엑시머 레이저를 켜고 갑상선 트론이 따뜻해질 수 있도록 하십시오. 광학 센서를 빔 출구 창에 배치하여 최소 100펄스에 대해 50 헤르츠의 주파수에서 레이저 에너지를 측정합니다. 500 마이크로리터 부피에서 약 10, 000개의 웜을 시료 주사기로 수동으로 인출합니다.
그런 다음 M9 버퍼의 2.5 밀리리터로 채우고 기포를 피하십시오. 적어도 10, 000 개의 벌레의 샘플 크기를 갖는 것이 중요합니다. 샘플 크기가 작으면 다운스트림 프로테오믹 분석을 위한 단백질 수율이 낮아집니다.
두 번째 주사기를 과산화수소 200밀리리터 3밀리리터로 채웁니다. 콘센트 모세관의 끝에, 40 밀리머 DMTU의 6 밀리리터와 15 밀리리터 원추형 튜브를 배치, 40 밀리머 PBN, 1 %시간 사과 소스 산화. 소프트웨어 창에서 엑시머 레이저를 시작하고 첫 번째 펄스를 기다린 다음 듀얼 주사기에서 샘플 흐름을 시작합니다.
시각적 누출에 대한 샘플 흐름을 적극적으로 모니터링하면서 15 밀리리터 튜브에서 전체 샘플을 수집합니다. 생체 내 FPOP 후, 2 분 동안 805 배 g에서 원심 분리에 의해 벌레를 펠릿. 담금질 용액을 흡인하고 250 마이크로리터의 허가된 버퍼를 추가합니다.
샘플을 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고, 플래시를 얼리고, 시료 소화가 끝날 때까지 음수 섭씨 80도에 보관하십시오. 웜 복구는 두 개의 서로 다른 내부 직경을 가진 모세 혈관을 사용하여 생체 내 FPOP 에서 비교되었다. 250 마이크로미터 의 내경 모세관을 사용했을 때, 두 개의 생물학적 복제에 걸쳐 63~89%의 총 시료 회수가 이루어졌습니다.
150 마이크로미터 의 내지름 모세관을 사용하면 21~31%의 회복만 이뤄집니다. 더 큰 내부 직경 모세관의 사용은 생체 내 FPOP 동안 더 나은 벌레 흐름으로 이어지며, 작은 모세관은 단일 웜 흐름을 허용하지 않으며, 여러 웜이 레이저 방사 창에서 함께 흐르는 것을 볼 수 있어 벌레당 레이저 노출의 양을 감소시다. FPOP 수정 및 수정되지 않은 펩타이드의 대표적인 추출 이온 크로마토그램은 하이드록실 라디칼이 산화변형 펩타이드의 화학작용을 변화시켜 더 극성있게 만드는 것으로 나타났다.
역상 크로마토그래피에서, 생체 내 FPOP 변형 펩타이드는 수정되지 않은 펩티드보다 더 일찍 보존 시간을 갖습니다. 절연 펩티드의 MS 단편화는 산화적으로 변형된 잔류물의 식별을 가능하게 합니다. 생체 내 FPOP는 C-elegans 내에서 두 개의 생물학적 복제에 걸쳐 총 545 단백질을 산화적으로 변형시켰습니다.
이 단백질 발자국 방법의 한 가지 장점은 벌레 내의 다양한 신체 시스템에서 단백질을 수정하는 능력입니다. 탠덤 MS 분석은 생체 내 생체 내 FPOP 프로브 용매 접근성에서 확인합니다. 미산 샤페론 단백질 UNC(45)를 가진 복합체에서 열충격 단백질(90)의 산화 패턴을 분석하고 4개의 산화변형 잔류물을 발견하였나.
생체 내 FPOP에 대한 C-elegans의 사용은 질병 병인에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 구조의 역할을 연구 할 수있는 잠재력을 제공합니다.
