우리가 여기서 제안하는 기술은 경험이 부족한 작업자의 경우에도 인접한 조직의 손상을 줄이고 재현성을 향상시킴으로써 수동 병변 프로토콜의 한계를 극복 할 수있게합니다. 이 기술을 사용하면 표적 UV 레이저와 결합 된 회전 유리 모세관 덕분에 주변 조직을 손상시키지 않고 병변을 유도 할 위치를 정확하게 선택할 수 있습니다. VAST 장비 작동에는 많은 단계가 관련되어 있으므로 모든 단계가 올바르게 수행되도록하기 위해 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
마취제를 함유 한 배지를 사용하여 유충을 마취시킨 다음 웰 당 300 마이크로 리터의 배지를 함유 한 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 절제용 레이저를 포함한 모든 시스템 구성 요소를 켭니다. 그런 다음 자동화 된 제브라 피쉬 이미징 또는 VAST 소프트웨어를 실행하고 첫 번째 창에서 플레이트를 선택한 다음 완료 버튼을 클릭하십시오.
모세관이 비어 있고 깨끗한지 묻는 작은 창이 나타납니다. 모세관 이미지에 내부에 기포가 있는지 확인하십시오. 내부에 기포가 없으면 팝업 창에서 예를 클릭하십시오.
다음으로 LP 샘플러 창에서 파일 메뉴로 이동하여 스크립트 열기 옵션을 선택하십시오. 수행할 실험에 해당하는 스크립트가 포함된 파일을 선택합니다. 그런 다음 기본 VAST 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 실험 열기를 선택합니다.
계획된 실험에 해당하는 실험 파일을 선택합니다. ImageJ / Fiji 소프트웨어를 실행하고 파일 메뉴로 이동 한 다음 새 스크립트를 선택하여 스크립트 창을 엽니 다. 그런 다음 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택하여 레이저 병변 스크립트를로드하십시오.
그런 다음 Python IDE를 시작하려면 파일 메뉴로 이동하여 파일 열기를 선택하여 레이저를 관리하는 스크립트를로드하십시오. 그런 다음 실행 메뉴를 클릭하고 디버깅하지 않고 실행을 선택하여 스크립트를 실행합니다. 레이저 감쇠기가 초기화되는 동안 터미널 패널의 메시지 시퀀스가 일부 노이즈와 함께 나타나는지 확인하십시오.
VAST 소프트웨어의 메인 창에서 화살표 버튼을 클릭하여 스테이지를 이동하고 현미경 목표를 기준으로 모세관을 중앙에 맞춥니다. 접안 렌즈를 살펴보고 현미경의 투과 된 빛을 사용하여 모세관 상단에 집중하십시오. 유충이 들어있는 96-웰 플레이트를 LP 샘플러의 왼쪽 플레이트 홀더에 놓습니다.
그런 다음 수집을 위해 다른 플레이트를 샘플러의 오른쪽 플레이트 홀더에 놓습니다. 플레이트의 A1 웰이 홀더의 왼쪽 앞쪽 모서리에 있는지 확인하십시오. VAST 소프트웨어의 LP 샘플러 창에서 플레이트 템플릿 버튼을 클릭하고 애벌레가 들어있는 모든 웰을 선택하십시오.
확인 버튼을 클릭하여 창의 유효성을 검사하고 닫습니다. 그런 다음 LP 샘플러 창에서 플레이트 실행 버튼을 클릭하여 애벌레 로딩을 시작하십시오. 그런 다음 현미경 소프트웨어로 이동하여 라이브 버튼을 클릭하여 애벌레를 이미지화하십시오.
척수 중앙 운하가 보일 때까지 현미경 초점 손잡이를 켭니다. 형광에서 스냅 샷을 찍고 이미지를 폴더에 저장하십시오. ImageJ에서 이미지를 열고 필요한 경우 대비를 조정합니다.
관심 영역 선 도구를 클릭하고 척수 중앙에 짧은 선을 그립니다. 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다. ImageJ 스크립트를 로드하고 반복을 2로, 샘플을 1로, 너비를 40미크론으로, 감쇠를 89로 설정합니다.
모든 매개 변수를 설정 한 후 OK 버튼을 클릭하십시오. 레이저 촬영 시퀀스가 완료되면 이미징 소프트웨어에서 형광 이미징으로 전환하고 초점을 조정합니다. 새 스냅숏을 만들어 저장합니다.
ImageJ에서이 새 이미지를 열고 척수 자체보다 큰 새 선을 그립니다. 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다. ImageJ 스크립트 창으로 이동하여 반복을 2로, 샘플을 1로, 너비를 40미크론으로, 감쇠를 89로 설정합니다.
모든 매개 변수를 설정 한 후 OK 버튼을 클릭하십시오. 레이저 샷 시퀀스가 끝나면 형광을 이미징하고 초점을 맞추어 트랜섹션 품질을 검증하십시오. 병변 부위에 세포나 축삭이 손상되지 않았는지 확인하십시오.
주요 VAST 소프트웨어 창으로 이동하여 수집 버튼을 클릭하여 병변 유충을 빈 96 웰 플레이트에 수집하십시오. 그런 다음 확인란 트레이 표시등을 클릭하여 VAST 시스템 표시등을 다시 켭니다. 가능한 한 빨리 96 웰 플레이트에서 유충을 꺼내어 유충이 병변 후 회복 할 수 있도록 신선한 생선 물이 담긴 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.
페트리 접시를 섭씨 28도의 인큐베이터에 넣으십시오. 아세틸화 튜불린 면역 염색 및 칼슘 이미징은 레이저 병변이 척추 조직의 연속성을 완전히 방해한다는 것을 나타냅니다. 이 이미지에는 손상되지 않은 척수가 표시됩니다.
병변의 caudal 및 rostral 측면 사이의 축삭의 완전한 붕괴는 척수의 완전한 횡단을 확인합니다. 불완전한 횡단의 예가 여기에 나와 있습니다. NBTG cAMP 6-S 유충의 횡단 척수가이 이미지에 표시됩니다.
사각형은 병변의 rostral 및 caudal 측에서 형광 강도를 정량화하는 데 사용되는 ROI를 보여줍니다. 그래픽 이미지는 로스트랄 및 인과적 분석 ROI에서 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타냅니다. NBT:dsRed 유충의 최대 강도 프로젝션 형광 이미지, 레이저 병변의 세 시간, 24시간 및 48시간 후의 레이저 병변이 여기에 도시되어 있다.
부상 후 24 시간 후, 상처가 닫히기 시작하여 48 시간 후에 척수의 초기 구조가 부분적으로 회복되었습니다. 부분적인 기능적 재연결은 칼슘 이미징을 사용하여 손상 후 48시간 후에 확인되었다. 인과 부위의 스파이크 진폭과 로스트랄 영역 사이의 비율은 부상 후 3, 24 및 48 시간 사이에 증가한 것으로 나타났습니다.
대식세포 모집은 NBT:dsRed mpeg1 GFP 유충 레이저 병변을 사용하여 레이저 병변 후에 관찰되었다. 수동 병변과 레이저 병변 사이의 표지된 세포의 수에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 병변이없는 물고기는 두 병변 조건에서 병변 된 물고기보다 이중 표지 된 세포가 적습니다.
레이저 병변은 수동 병변보다 근육과 피부 손상을 덜 유도합니다. 병변이 완전한지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 손상되지 않은 세포나 구조는 병변 부위에 보이지 않아야하며 희미한 배경 만 볼 수 있어야합니다.
척수 재생을 연구하기 위해, 우리는 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징을 포함한 많은 방법을 사용합니다. 중요하게도, 우리는 또한 조직이 수동으로 병변 한 동물과는 달리 해부를 견딜 수 있기 때문에 전기 생리학을 할 수 있습니다. 이 새로운 기술을 통해 우리는 재현 가능하고 통제 된 병변을 허용함으로써 손상 후 척수의 구조적 및 기능적 조직 조직을 정량적으로 연구 할 수 있습니다.
