이 프로토콜은 해양 골반 투니케이트 Oikopleura 디오이카를 위한 장기적고 신뢰할 수 있는 배양 시스템을 구축하는 방법을 시각적으로 보여줍니다. Oikopleura 배양 시스템은 생태학, 발달, 유전체학 및 진화와 관련된 광범위한 생물학적 분야를 조사하기 위한 기준자원을 제공합니다. 이 종은 짧은 수명 주기, 높은 fecundity를 가지고 있으며, 쉽게 우수한 모델 유기체만들기, 해안에서 수집 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 O.dioica에 최적화되어 있지만 다른 판크토닉 유기체에 적용 될 수 있기를 바랍니다. 먼저 여과된 바닷물을 자동화하는 것부터 시작하여 Oikopleura 문화를 유지하기 위해 조류 음식을 시작하십시오. 채토세로스 칼시트랜스의 주식 문화를 시작하기 위해, 오토클레이브 해수 의 60 밀은 다음과 같은 보충되었다: 30 비타민의 마이크로 리터, 용액 A의 마이크로 리터 30 마이크로 리터, 나트륨 규산염의 15 마이크로 리터, 그리고 60 연쇄 상감술의 마이크로 리터.
마지막으로, 이전 주식 문화에서 C.calcitrans의 30 마이크로 리터는 무분이한 것으로 추가되었습니다. 다른 조류 종 및 문화 유형에 대한 보충 및 접종 볼륨에 관한 원고의 표 2를 참조하십시오. 접종 후, 주식과 하위 문화는 연속 조명과 섭씨 17도에서 인큐베이터로 유지됩니다.
약 10 일 후, 조류 성장은 플라스크가 착색됨으로써 확인됩니다. 이 경우 동일한 인큐베이터에서 하위 문화를 유지하면서 최대 1개월 동안 4도의 장기 보관으로 주식 문화를 이동합니다. 작업 문화를 만들기 위해, 에 필요한 보충제를 추가 400 오토 클레이브 바닷물의 밀과 접종 100 이전 하위 문화의 밀.
플라스크를 고무 캡으로 밀봉하고, 일회용 파이펫을 삽입하고, 조류 스테이션으로 옮기고 8시간의 포토기간과 일정한 폭기로 실온에서 유지합니다. 플라스크 의 바닥에 응집을 방지하기 위해 수동으로 하루에 두 번 조류 문화를 소용돌이. 조류 문화가 확립되면 현지 사이트에서 현장 샘플을 수집합니다.
플랑크톤 그물을 캐스팅하고 대구 끝이 표면 아래 1~2미터 가라앉을 수 있도록 합니다. 초당 약 5~1m의 속도로 그물을 견인합니다. 2~5분 간 계속 견인합니다.
견인 시간은 현장에서 플랑크톤 풍부에 따라 조정되어야 합니다. 견인 후 조심스럽게 그물을 들어 올려 대구 끝의 내용을 500 mil, 유리 병으로 천천히 전달합니다. 수송 하는 동안 동물에 게 스트레스를 일으킬 수 있는 기포를 피하기 위해 테두리에 병을 채우기.
이 단계에서, 오이코플레라의 존재는 어두운 배경에 대한 샘플 병을 보고 확인할 수 있습니다. 그러나 종 수준의 식별을 위해서는 현미경 관찰이 필요합니다. 500마일 병 3개가 수집될 때까지 이 과정을 반복하십시오.
CTD 프로파일러를 사용하여 염도, 온도 및 엽록소 농도를 기록하기 위해 표면 해수를 수집합니다. 또한 10~15리터의 현장 해수를 수집하여 동물을 실험실 조건에 적응시킬 수 있도록 도와줍니다. 동물을 적응시키기 위해, 실험실에서 유지되는 견본 부지 및 여과된 해수에서 표면 해수의 일대일 비율을 준비합니다.
최종 부피는 플랑크톤 샘플의 농도에 따라 5~10리터 사이로 조정되어야 한다. 500mil 샘플을 준비된 비커에 조심스럽게 추가합니다. 15 RPM에서 회전하는 동기 모터에 부착 된 패들을 사용하여 플랑크톤을 밤새 서스펜션상태로 유지하십시오.
다음 날 아침, 눈으로 오이코플라의 존재를 확인하십시오. 동물을 페트리 접시로 옮기고, 양성 식별을 위해 20~40배 배율로 설정된 암암장 현미경으로 관찰한다. 오이코플레우라는 반투명 주택 안에서 꼬리를 기복하는 올챙이 모양의 동물로 특징지어졌습니다.
O.dioica를 확인하려면 노란색 조나드또는 계란이있는 암컷이있는 완전히 성숙한 남성을 찾으세요. 동물이 미숙한 경우 꼬리의 말단 절반에 두 개의 하위 코드 세포의 존재를 찾습니다. 이들은 성숙하고 미숙한 동물 둘 다에 있습니다.
종이 확인되면, 새로운 페트리 요리로 전송합니다. 10~20명의 개인이 종 수준에서 확인될 때까지 이 과정을 반복하십시오. O.dioica가 발견되지 않으면 비커가 하루 이틀 동안 교반하십시오.
처음에 관찰할 수 없었던 작은 O.dioica는 계속 성장하고 쉽게 볼 수 있게 될 것입니다. 1주일 후에 나타나지 않으면 샘플을 버리고 다시 샘플링해 봅보십시오. 단문화를 확립하기 위해, 여과된 해수 5리터의 필드 샘플에서 120 O.dioica를 분리한다.
다음 날 아침, 노란 조나드로 확인된 완전히 성숙한 남성과 반짝이는 황금구체로 나타나는 달걀을 가진 암컷을 찾아보세요. 15명의 수컷과 30명의 암컷을 5밀, 무딘 파이펫으로 2.5리터의 여과된 바닷물이 들어있는 비커로 부드럽게 이송하여 산란 비커를 준비한다. 수동 이송 중에 물리적 인 스트레스를 최소화하기 위해 새로운 바닷물의 표면 아래에 동물을 천천히 놓습니다.
고립된 성인이 자연스럽게 생성되도록 허용합니다. 산란 후, 성공적인 수정은 산란 비커의 바닥에서 바닷물의 5 ~ 10 마일을 추출하고 현미경의 밑에 분열로 계란을 식별하여 확인할 수 있습니다. 산란 후 첫 날 아침, 부풀린 집을 가진 새로운 세대의 젊은 동물이 비커에 나타나야 합니다.
500mil 핸드헬드 비커를 사용하여 7.5리터의 신선하고 여과된 바닷물이 들어있는 새로운 비커로 동물을 부드럽게 이송합니다. 난기류와 전단력을 최소화하기 위해 표면에 천천히 콘텐츠를 붓습니다. 산란 후 둘째 날 아침, 둘째 날, 150마리의 동물을 신선하고 여과된 바닷물이 들어 있는 새로운 비커로 수동으로 옮겨넣습니다.
3일 아침, 산란 후 세 번째 아침에120마리의 동물을 신선하고 여과된 바닷물이 있는 새로운 비커로 수동으로 옮겨보었습니다. 4일째가 되면 성적으로 성숙하고 어른의 동물이 있어야 합니다. 다음 세대를 시작하기 위해 2.5 리터의 여과 된 바닷물이있는 새로운 산란 비커를 위해 15 명의 수컷과 30 명의 암컷을 수집하십시오.
이 과정은 문화의 삶을 위해 반복되고 유지됩니다. O.dioica의 단일 문화를 유지하기 위해, 조류 음식은 노동 문화에서 매일 준비됩니다. 동물은 하루에 세 번 먹입니다.
660 나노미터로 설정된 분광계를 사용하여 작업 문화의 흡수성을 측정하여 일일 음식을 준비합니다. 흡수값, 표적 O.dioica 배양량 및 동물의 성숙도는 이전에 결정된 조류 성장 곡선을 기반으로 준비된 스프레드시트에 배치되어 당일 수유에 필요한 정확한 조류 양을 계산합니다. 계산된 볼륨을 50mil 튜브로 파이프, 실온에서 5분 동안 5, 000g의 원심분리기.
서서히 상체를 부어, 조심스럽게 위아래로 피펫을 위아래로 피펫하여 펠렛 조류를 다시 중단합니다. 신선한 여과 된 바닷물로 튜브를 원래 볼륨으로 리필하십시오. 스프레드시트의 일일 조류 공급 차트를 기반으로 지정된 금액을 각 비커에 공급하여 .m.
12 p.m. 및 5 p.m. 5 p.m에서 동물을 먹이기 위해 자동 도징 펌프를 설정할 수 있습니다.
주말에는 배양 직원의 존재없이. 각 수유 후, 다음 사료에 사용할 준비가 될 때까지 4섭씨에서 준비된 조류 식품을 유지하십시오. O.dioica는 100 미크론 메쉬와 비 필터링 대구 끝이 장착 된 수정 된 플랑크톤 그물의 부드러운 견인에 의해 항구에서 수집 할 수 있습니다.
2015년과 19일 사이에 샘플링을 통해 오키나와 항구에 O.dioica가 있는 계절적 변화를 보였습니다. 표면 해수 온도는 동물의 존재에 영향을 미치는 것 같았다. 표면 해수 온도가 28도 이상이었을 때 O.dioica가 지배했습니다.
O.dioica는 24~27도 의 온도에서 오이코플레우라 롱카우다와 공존했습니다. 그러나 O.longicauda는 23도 이하의 온도에서 지배했습니다. 살리니티의 변화는 O.dioica의 풍요로움과 상관관계가 없었다.
안정적인 O.dioica 문화 시스템을 구축하기위한 세 가지 가장 중요한 요소는 다단계 여과 시스템으로 높은 수질을 유지하고, 최적 공급 체제를 식별하고, 바람직하게는 조류 표준 곡선을 생성하고, 남성과 여성의 충분한 수의 비커를 산란하는 것입니다. 제공된 프로토콜에 따라 O.dioica의 수명 주기는 23도에서 4 일입니다. 우리는 안정적으로 O.dioica의 여섯 독립적 인 인구를 설립했습니다, 모두는 20 세대 이상 지속.
결론적으로, O.dioica의 안정적인 문화를 확립하는 것은 신속하고 비용 효율적으로 수행 할 수 있습니다. 적절한 설정을 통해 1주일 이내에 안정적인 문화를 달성할 수 있습니다. 작은 게놈과 빠른 수명 주기와 함께, 이것은 O.dioica 강력한 화음 모델 종을 만든다.
O.dioica는 인공 및 천연 바닷물 모두에서 유지 될 수있다. 고체 문화와 냉동 보존을 사용하여 조류 식품의 장기 저장이 가능합니다. 또한, O.dioica 정자는 또한 극저온 보존 될 수 있으며 1 년 이상 실행 가능한 상태로 유지 될 수 있습니다.
O.dioica는 다양한 생물학적 분야에 대한 강력한 통찰력을 지속적으로 제공합니다. 지역 계절성, 세심한 문화 시스템, 그리고 소수의 헌신적인 개인에 대한 이해는 약간의 노력으로 효과적인 문화를 확립할 수 있도록 합니다.
