다시마 숲은 기후로 인한 환경 스트레스 요인과 영양 역학의 변화로 인해 전례 없는 손실에 직면해 있습니다. 이 비디오는 녹색 자갈 기술을 사용하여 자이언트 켈프(Macrocystis pyrifera)를 배양하기 위한 프로토콜과 도구를 보여주며, 다양한 환경에서 이 방법의 성공과 한계를 해결하기 위한 추가 시도를 위한 귀중한 리소스를 제공합니다. 다시마 재배 시설은 섭씨 10도에서 15도 사이의 온도를 제어할 수 있어야 하며, 제곱 미터당 0에서 180 마이크로몰 광자 범위의 전체 스펙트럼 광과 여과된 폭기를 제공할 수 있어야 합니다.
콘센트가 내장되어 있거나 전선 및 튜브용 액세스 포트가 있는 인큐베이터 시스템은 조명과 공기 공급원으로 조정할 수 있습니다. 인큐베이터 시스템이 프로젝트의 범위, 예산 또는 의도한 규모 내에 있지 않은 경우 시원한 천연 해수로 템퍼링된 수조 또는 냉각기를 사용할 수 있습니다. 사육 온도는 현장과 계절에 따라 다릅니다.
온도계를 성장 배지에 넣거나 온도 총을 사용하여 온도가 섭씨 10도에서 18도 사이인지 확인하십시오. 광원의 타이밍 설정을 사용하거나 광원을 프로그래밍 가능한 주기가 있는 타이머에 연결하여 전체 스펙트럼 조명을 12시간 조명, 12시간 어두운 사진 기간으로 설정합니다. 자갈 근처의 표면 아래에 있는 PAR 양자 측정기로 광도를 측정하고 디밍이 가능한 광원을 사용하거나 광원 위에 메쉬를 레이어링하여 조정합니다.
폭기는 공기 펌프를 사용하여 배양물에 추가됩니다. 공기 중 박테리아 오염을 줄이기 위해 02마이크로미터의 기공 크기를 가진 필터를 사용하십시오. 재료와 스테이션은 미리 멸균하고 준비해야 합니다.
자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 파종에 사용되는 자갈은 질감이 있거나 약간 움푹 들어간 표면이 있어야 하는데, 이는 생식동물이 높은 울퉁불퉁함을 가진 기질에 남아 있을 가능성이 더 높기 때문입니다. 먼지나 부스러기를 제거하기 위해 물이 맑아질 때까지 자갈을 문지르고 헹굽니다.
10% 희석된 표백제 용액에 자갈을 최소 24시간 동안 담그고 필터 멸균 해수로 헹굽니다. 매주 배양 용기를 새로 고치는 데 필요한 필터 멸균 해수의 양을 계산하고 그에 따라 이 여과 및 멸균 작업을 예약합니다. 필터 멸균 처리된 해수의 대량은 섭씨 8도에서 10도에서 최대 6개월 동안 어두운 용기에 보관할 수 있습니다.
냉장 보관할 수 없는 경우 어둡고 서늘한 곳에 보관하십시오. 기공 크기가 55-1마이크로미터인 진공 여과 시스템을 사용하여 물을 여과합니다. 필터 손상을 방지하기 위해 물을 모두 빼내기 전에 진공 소스를 끄고 여과된 물을 전용 멸균 용기에 붓습니다.
더 큰 부피의 경우 플로우 스루 여과 시스템을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 가장 큰 공극 크기에서 가장 작은 공극 크기로 배열된 10마이크로미터, 5마이크로미터, 1마이크로미터의 일련의 3개의 주름 필터를 통해 해수를 흘려보냅니다. 이 플로우 스루 시스템은 수족관 UV 조명에 연결됩니다.
UV 및/또는 고압멸균 방법을 사용하여 여과된 해수를 살균합니다. 여과 살균된 바닷물에 영양분과 비타민을 풍부하게 공급하는 것은 다시마 성장에 매우 중요합니다. 일반적인 농축 옵션에는 프로바솔리가 농축된 해수 배지 및 F/2 배지가 포함됩니다.
자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 현지 법률 및 규정을 충족하는 다시마 조직 수집에 필요한 허가를 받으십시오. 스쿠버를 통해 10-15마리의 비옥한 Macrocystis pyrifera 개체에서 2-5m 간격으로 눈에 띄는 소리를 가진 3-5개의 sporophyll 블레이드를 선택합니다.
가능하면 오염이나 분해가 거의 또는 전혀 없는 깨끗하고 온전한 포자를 선택하십시오. 이 시점부터 부모 개체에 따라 sporophyll 블레이드를 별도로 보관하십시오. 포자충은 다 자란 다시마의 받침 위 밑부분의 빽빽한 치마에서 자라며 가스로 가득 찬 폐낭이 없는 것으로 식별할 수 있습니다.
스포자 필 블레이드는 어두운 수집 백에 담아 어두운 수집 백에 담아 운반하고, 블레이드를 젖은 상태로 유지하기 위해 현장에서 바닷물을 최소한으로 채우고 배양 공간에 도착할 때까지 약 섭씨 12도의 냉각기에 보관합니다. 샘플이 얼음과 직접 접촉하지 않도록 하십시오. Sporophylls는 다른 위치로 또는 다른 위치에서 배송할 수 있습니다.
여과된 멸균된 바닷물로 포자를 헹굽니다. Macrocystis pyrifera 개체에서 채취한 칼날을 여과된 멸균된 바닷물에 적신 축축한 종이 타월로 감싸고 빛 침투 및 추가 건조를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 다시 감쌉니다. 이 보관 방법은 일반적으로 부리또 방법으로 알려져 있습니다.
이 패키지를 재활용 버블 랩 또는 판지와 같은 보호 장벽이 있는 얼음이 있는 쿨러에 넣으십시오. 익일 배송을 위해 쿨러를 준비하고 배송을 수령할 수 있는 사람이 있는지 확인하고 패키지를 냉장 상태로 보관합니다. 선택적으로, 포자를 냉장 상태에서 12-48시간 동안 보관하여 소러스 조직에서 포자 방출을 촉진합니다.
보관하려면 부리또 방법을 사용하십시오. 선택적으로 보관하는 경우 비옥한 sorus 조직의 존재를 나타내는 종이 타월에서 부분적인 포자 형성의 증거를 찾으십시오. 흉창 조직은 종종 주변 조직보다 약간 융기되고 색이 어둡습니다.
잘 익은 소러스 조직을 선택하고 멸균 가위를 사용하여 25cm 정사각형 섹션으로 자릅니다. 유전적 다양성을 촉진하기 위해 10-15마리의 개별 다시마 부모 중에서 1-2개의 깨끗한 소리 섹션을 선택합니다. 청소하려면 멸균 거즈로만 소러스 조직의 양쪽을 한 방향으로 부드럽게 문지릅니다.amp필터로 멸균된 바닷물을 적십니다.
필요한 경우 멸균 면도날로 소러스 조직을 부드럽게 긁어냅니다. 소리 부분을 담수탕에 30초에서 1분 동안 담그고 필터 멸균 바닷물로 헹굽니다. 멸균된 50밀리리터 팔콘 튜브 안에 섭씨 10도에서 15도로 템퍼링된 필터 멸균 해수에 각 소리 섹션을 담그십시오.
또는 소리 절편이 단일 멸균 용기에 포자될 수 있습니다. 섭씨 4도에서 12도의 튜브를 어두운 곳에 두어 최대 4시간 동안 포자를 형성합니다. 냉장고가 없는 경우 조명이 어둡고 서늘한 곳에 보관하십시오.
복합 현미경과 혈구계를 사용하여 30분에서 최대 4시간마다 3-4개 샘플의 포자 밀도를 관찰합니다. 샘플 간에 피펫 팁을 변경합니다. 조밀도가 적어도 10 의 밀리리터 당 000의 포자인 경우에, 다음 단계로 넘어서십시오.
소리 절편에서 4시간 후에도 포자가 생성되지 않으면 샘플을 폐기하십시오. 포자는 방출 후 몇 시간 이내에 가라앉을 수 있지만 원을 그리며 헤엄치는 것이 관찰될 수 있습니다. Falcon 튜브에서 각 소리 섹션을 제거합니다.
생성된 포자 용액을 단일 멸균 용기에 결합하고 최종 결합 밀도를 정량화합니다. 500 의 배양 콘테이너에 있는 밀리리터 당 000의 포자의 마지막 농도를 위한 접종에 필요한 포자 해결책의 마지막 양을 산출하십시오. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오.
멸균 유리 슬라이드를 배양 용기 내에 넣어 다시마 발달을 모니터링합니다. 충분한 모니터링을 위해 배양 용기에 무작위로 배포된 최소 30개의 슬라이드를 포함합니다. 성장 배지에 잠긴 기질이 포함된 멸균 피펫 팁을 사용하여 계산된 양의 포자 용액을 배양 용기에 접종합니다.
용기를 닫고 포자를 분산시키기 위해 부드럽게 저어줍니다. 용기를 배양 시스템에 넣습니다. 배포 사이트의 온도에 따라 섭씨 10도에서 15도 사이로 온도를 설정합니다.
수생 식물을 위한 전체 스펙트럼 조명은 12시간 조명, 12시간 다크 사이클로 설정되며 광도는 제곱초 미터당 0에서 180마이크로몰 광자 사이입니다. 특정 조명 조건의 타임라인에 대한 텍스트를 참조하십시오. 하루 후 여과된 공기 공급원으로 가벼운 폭기를 제공하십시오.
매일 또는 처음 2주 동안 격일로 최소 2개의 무작위 유리 슬라이드를 모니터링하여 발달을 평가합니다. 2주 후, 포자식물의 크기가 1-2cm가 될 때까지 일주일에 1-2회 최소 2개의 무작위 유리 슬라이드를 모니터링하여 건강한 성장과 오염을 확인합니다. 모니터링하려면 멸균된 핀셋으로 슬라이드를 다루고 유리 슬라이드가 잠길 수 있을 만큼 충분한 멸균된 바닷물이 들어 있는 깨끗한 페트리 접시에 담습니다.
교차 오염을 방지하기 위해 유리 슬라이드를 제거한 후 배양액으로 되돌리지 마십시오. 화합물 또는 도립 현미경을 40-400배 배율로 사용하여 초기 단계의 다시마를 관찰합니다. 개발은 다음 일정을 추적할 것으로 예상됩니다.
침전된 포자는 0일에서 1일에 관찰됩니다. 포자는 몇 시간 내에 발아할 수 있으며, 이는 생식관의 형성으로 입증됩니다. 발아는 일반적으로 하루에서 이틀 후에 관찰됩니다.
초기 생식동물은 일반적으로 1일에서 4일 사이에 관찰됩니다. 세포가 분열과 분화를 거쳐 남성과 여성의 배우자를 형성하는 과정인 생식세포 형성은 일반적으로 처음 2주 이내에 관찰됩니다. 암컷의 세포는 수컷보다 5배에서 7배 더 큽니다.
수컷 생식 식물은 얇은 사상 가지를 자라는 반면 암컷은 더 둥글거나 난형 모양입니다. 암컷은 일반적으로 2-3주 이내에 알을 낳습니다. 수컷에서 방출된 정자는 난자를 수정시켜 배아 포자식물로 발달합니다.
포자식물은 일반적으로 2-4주 이내에 관찰됩니다. 접합체는 빠른 세포 분열을 거쳐 약 6-8주 내에 1-2cm의 잎이 자랍니다. 매주 성장 배지를 교체하여 Macrocystis pyrifera 성장에 필요한 영양소와 미네랄을 보충하십시오.
신선한 성장 배지를 적절한 온도로 식힙니다. 이 과정에서 성장 배지가 섭씨 15도를 초과하지 않도록 하십시오. 파종된 기질의 방해를 피하기 위해 배양 용기에서 배지를 사이펀합니다.
용기가 거의 비워질 때까지 미디어를 비우십시오. 건조를 최소화하기 위해 즉시 미디어를 새로 고칩니다. 재충전할 때 성장 용기를 약간 기울여 배지가 배양 용기 측면을 따라 흘러내려 기질을 최소화합니다.
빛 방사 조도의 차이를 설명하기 위해 주간 미디어 교체 중에 용기 또는 욕조 위치를 무작위로 재배열합니다. Macrocystis 배양에 대한 활동과 기대치를 추적하기 위해 달력 텍스트를 참조하십시오. 빛과 폭기에 대한 조정 시기와 주간 미디어 변경을 나타냅니다.
6-8주간의 실험실 배양 후, 어린 포자식물은 길이가 1-2cm이고 배치할 준비가 됩니다. 배포 24시간 전에 배양 컨테이너에서 성장 배지를 새로 고칩니다. 현지 법률 및 규정을 충족하는 자갈 배치에 필요한 허가를 받으십시오.
그늘진 냉각기에서 최대 6시간 동안 녹색 자갈을 운반하십시오. 배치는 가장 직사광선을 피하도록 시간을 정해야 합니다. 배치 과정에서 직사광선을 피하기 위해 보트의 그늘진 구조를 활용하십시오.
표면에서 아래의 산호초로 녹색 자갈을 조심스럽게 흩뿌리거나, 새로운 사이트와 작은 규모에서 시험할 때 스쿠버를 통해 뿌립니다. 녹색 자갈 복원 기술은 다른 종에 대한 제한된 식물 생존 데이터와 Macrocystis pyrifera에 대한 데이터가 아직 없는 학술 단계에 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 분야에서의 성공은 최근 파일럿 연구에서 관찰되었는데, 이는 현장에서 2개월 후 최대 1.2m까지 자라는 주변 기질과 어린 다시마에 대한 haptera 부착으로 나타났습니다.
이 프로토콜에 요약된 현장 수집 및 실험실 유지 관리를 사용하여 섭씨 12도와 섭씨 20도에서 두 개의 뚜렷한 기증자 다시마 집단을 배양하여 시간 경과에 따른 Macrocystis pyrifera의 미세 단계 발달에 대한 온도 의존적 영향을 설명했습니다. 24일 후, 현미경 이미지로부터 생식동물을 계수하였다. 온도는 더 차가운 K1 개체군에는 영향을 미쳤지만 K4 개체군에는 영향을 미치지 않았으며, 이는 열 내성 형질의 적응적 발산이 가능할 수 있음을 시사합니다.
이는 현장별 사육 온도의 중요성을 강조합니다. 32일 후, 눈에 보이는 포자식물이 각 유리 슬라이드에서 계산되었습니다. 온도는 K1 및 K4 집단 모두에 대해 유사한 영향을 미쳤습니다.
섭씨 20도에서 사육된 샘플은 섭씨 12도에서 사육된 샘플에 비해 눈에 띄는 포자식물이 거의 자라지 않았습니다. 이 결과는 포자식물 생산이 생식식물 단계보다 온도에 더 민감하며, 프로토콜에 설명된 대로 포자식물 발달을 달성하기 위해 배양 온도가 섭씨 15도를 초과해서는 안 된다는 것을 시사합니다. 이 시각화된 프로토콜을 통해 우리는 전 세계 연구자와 관리자가 귀중한 수중 다시마 숲을 복원하기 위해 녹색 자갈 방법에 대한 추가 시도를 장려하기를 희망합니다.
Macrocystis pyrifera와 함께하는 녹색 자갈 여행에 행운을 빕니다.
