gnotobiotic 바퀴벌레 생성 프로토콜은 네이티브 창자 미생물 지역 사회 제거및 호스트 건강 및 미생물군유전체 조립에 대한 교체의 영향의 테스트를 용이하게합니다. 이 기술은 여러 소스의 방법을 사용하여 고가의 특수 실험실 장비를 사용하지 않고 노토바이오틱 바퀴벌레를 생성하기 위한 응집력 있는 간소화된 워크플로우를 형성합니다. 이 gnotobiotic 프로토콜의 많은 다른 움직이는 부분을 고려, 시각화는 연구원이 더 쉽게 자신의 작은 규모, 저렴한, 벤치 탑 gnotobiotic 시설을 설정하는 데 도움이됩니다.
계획된 실험에 대해 oothecae를 운반하는 여성의 적절한 수의 수집을 용이하게하기 위해, 스톡 탱크에 중력 여성을 포함하는 골판지 튜브를 이동하는 집게를 사용합니다. 골판지 튜브에 중력 여성 이외에 여러 곤충이 포함되어 있는 경우 튜브 내용물에 석유 젤리로 울리는 추가 플라스틱 용기에 넣고 대상 곤충이 골판지 튜브로 혼자 올라가도록 장려합니다. 수집 시 각 그레이드 여성을 출산 병동으로 옮길 수 있습니다.
암컷이 오테카를 떨어뜨리면 암컷을 스톡 탱크로 돌려보내서 집게를 사용하여 쓰레기에서 오테카를 회수하십시오. oothecae를 청소하려면, 나트륨 도데실 황산염의 3 밀리리터를 포함하는 5 밀리리터 원심분리기 튜브에 최대 5개의 계란 케이스를 놓고 10 초 동안 oothecae를 소용돌이. 두 번째 세척 후, 섬세한 작업 닦기를 사용하여 각 오테카의 표면을 부드럽게 문질러 파편을 제거하고 청소된 ootheca를 계량 보트에 넣습니다.
살균하기 전에 오테카 당 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브 2개를 튜브 당 1밀리리터의 멸균수로 채웁니다. 또한 연기 후드에 5 밀리리터 원심분리기 튜브에 3.2 밀리리터의 이중 증류수 3.2 밀리리터에 32%의 peracetic acid 스톡 솔루션 10마이크로리터를 추가합니다. 캡과 혼합 하고 5 분 동안 갓 준비 된 0.1 %의 peracetic 산 용액에 최대 5 개의 세척 된 oothecae를 배치 하 여 튜브를 60 초마다 여러 번 반전.
과자산은 눈, 피부 및 호흡기 자극제의 강한 산화제이며 인화성 및 부식성입니다. 항상 적절한 PPE를 착용하고 폐기물을 적절히 처리하십시오. 인큐베이션이 끝나면 멸균 집게와 라미나르 플로우 후드를 사용하여 각 ootheca를 멸균 헹구기 물의 자체 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
헹구는 물의 튜브의 두 번째 세트로 oothecae를 전송하기 전에 혼합하려면 여러 번 반전하십시오. 두 번째 헹구기 후 멸균 집게를 사용하여 각테카를 개별 BHI 경사로 옮깁니다. 경사를 멸균 보조 용기에 넣고 부화될 때까지 4~5주 동안 용기를 가습된 섭씨 30도 인큐베이터로 옮킨다.
4 주까지 곰팡이 또는 세균 성 성장을 위해 일주일에 1 ~ 2 번 정기적으로 경사를 확인하십시오. 님프가 부화하기 시작하면 멸균 집게와 라미나르 플로우 후드를 사용하여 멸균 된 쥐 차우의 펠릿을 준비 된 BHI 플라스크로 무균하게 전달하십시오. 멸균 검사로서 플라스크를 30도-섭씨 인큐베이터에 24시간 동안 배치하여 오염된 성장의 부족을 확인합니다.
플라스크가 멸균 상태로 남아 있다면, 경사에서 님프를 흔들어 라미나르 플로우 후드의 플라스크에 빠지게하십시오. 그런 다음 laminar 흐름 후드에서 일주일에 한 번 멸균 물 300 마이크로 리터로 님프에게 물을 주입니다. nymph 대변이 중간 층을 커버하기 시작하면, 입증 된 바와 같이, 사전에 추가 살균 쥐 차우를 포함하는 새로운 BHI 플라스크로 님프를 전송.
임신 한 여성은 후방 복부에 부착 된 ootheca에 의해 식별 될 수 있습니다. 오스테카에는 살균 후 평균 34일을 부화합니다. 살균에 실패한 경우, 배양 중에 oothecae 주위에 성장이 나타날 수 있으며, 새끼 의 노토바이오틱 상태를 손상시킬 수 있습니다.
그런 다음 곤충 체길이를 측정하여 심경 성장 속도를 추적할 수 있다. 균일화된 nymph로부터의 16S 리보소말 DNA의 제한 단편 길이 다형성은 뇨토바이오틱 상태를 확인하는 데 사용될 수 있다. Gnotobiotic 바퀴벌레합성 또는 제노바이오틱 미생물 공동체로 접종할 수 있습니다.
이 특정 워크플로우가 새로운 동안, gnotobiotic 바퀴벌레를 사용하여 이전 연구는 사회적 행동, 창자 건강 및 곤충 호스트의 면역을 형성하는 창자 미생물 어셈블리 및 미생물 역할에 대한 통찰력을 생성했습니다.
