Gnotobiyotik hamamböceği oluşturma protokolü, yerel bağırsak mikrobiyal topluluğunun çıkarılması ve değiştirilmesinin konak sağlığı ve mikrobiyom montajı üzerindeki etkisinin testini kolaylaştırır. Bu teknik, pahalı özel laboratuvar ekipmanı kullanmadan gnotobiyotik hamamböceği üretmek için uyumlu, kolaylaştırılmış bir iş akışı oluşturmak için birden fazla kaynaktan yöntemler kullanır. Bu gnotobiyotik protokolün birçok farklı hareketli parçasını göz önünde bulundurarak, görselleştirme araştırmacıların kendi küçük ölçekli, düşük maliyetli, tezgah üstü gnotobiyotik tesislerini daha kolay kurmalarına yardımcı olur.
Planlanan deneyler için oothecae taşıyan uygun sayıda dişinin toplanmasını kolaylaştırmak için, stok tankında gravid dişiler içeren karton tüpleri taşımak için forseps kullanın. Bir karton tüp gravid dişiye ek olarak birden fazla böcek içeriyorsa, tüp içeriğini petrol jeli ile halkalanmış ek bir plastik kap haline koyun ve hedef böceği tek başına karton tüpe geri tırmanmaya teşvik edin. Tahsilat üzerine, her gravid kadını doğum servisine aktarın.
Dişiler oothecae'lerini düşürdükten sonra, dişileri stok tankına geri verin ve oothecae'yi çöpten almak için tokalar kullanın. Oothecae'yi temizlemek için, üç mililitre sodyum dodecyl sülfat içeren beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne beş adede kadar yumurta kasası yerleştirin ve oothecae'yi 10 saniye boyunca girdaplayın. Az önce gösterildiği gibi ikinci bir yıkamadan sonra, herhangi bir enkazı gidermek ve temizlenmiş ootheca'yı bir tartım teknesine yerleştirmek için her ootheca'nın yüzeyini hafifçe ovalamak için hassas bir görev mendili kullanın.
Sterilizasyondan önce, ootheca başına iki adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpünü tüp başına bir mililitre steril su ile doldurun. Ayrıca duman kaputunda beş mililitrelik santrifüj tüpüne 3,2 mililitre çift damıtılmış suya 10 mikrolitre%32 perasetik asit stok çözeltisi ekleyin. Beş dakika boyunca taze hazırlanmış% 0.1 perasetik asit çözeltisine beş adede kadar temizlenmiş oothecae'yi karıştırmak ve yerleştirmek için birkaç kez kaplayın ve ters çevirin, tüpü her 60 saniyede birkaç kez ters çevirin.
Perasetik asit, göz, cilt ve solunum tahriş edici güçlü bir oksitleyicidir ve yanıcı ve aşındırıcıdır. Atıklarınızı taşıma sırasında her zaman uygun KKD'yi giyin ve uygun şekilde atın. Kuluçkanın sonunda, her ootheca'yı kendi steril durulama suyu santrifüj tüpüne aktarmak için steril tokmaklar ve laminer akış başlığı kullanın.
Oothecae'yi ikinci durulama suyu tüplerine aktarmadan önce karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. İkinci durulamadan sonra, oothecae'yi bireysel BHI eğimlerine aktarmak için steril önkseçler kullanın. Çekikleri sterilize edilmiş ikincil bir kaba yerleştirin ve kabı yumurtadan çıkana kadar dört ila beş hafta boyunca nemlendirilmiş 30 santigrat derecelik bir inkübatöre taşıyın.
Dördüncü haftaya kadar haftada bir ila iki kez düzenli olarak mantar veya bakteri üremesini kontrol edin, bu noktada çekikler günlük olarak kontrol edilmelidir. Nimfler yumurtadan çıkmaya başladığında, sterilize edilmiş bir fare çorbası peletini hazırlanmış bir BHI şişesine aseptik olarak aktarmak için steril bir tokmak ve laminer akış başlığı kullanın. Sterilite kontrolü olarak, şişeyi kontamine büyüme eksikliğini doğrulamak için 24 saat boyunca 30 santigrat derecelik inkübatörde ikincil kaba yerleştirin.
Matara steril kaldıysa, perileri eğimden sallayın ve laminer akış başlığındaki şişeye düşmelerini izinlayın. Daha sonra nimfleri laminer akış başlığında haftada bir kez 300 mikrolitre steril su ile sulayın. Nimf dışkı orta katı kaplamaya başladığında, gösterildiği gibi, perileri 24 saat önceden eklenen sterilize edilmiş sıçan yemeği içeren yeni bir BHI şişesine aktarın.
Hamile dişiler, arka karınlarına bağlı ootheca ile tanımlanabilir. Oothecae, sterilizasyondan ortalama 34 gün sonra yumurtadan çıkar. Başarısız sterilizasyon durumlarında, kuluçka sırasında oothecae çevresinde büyüme ortaya çıkabilir ve yavruların gnotobiyotik durumunu tehlikeye atabilir.
Daha sonra nemsel büyüme oranı, böcek vücut uzunluğu ölçülerek izlenebilir. Homojenize bir nimften 16S ribozomal DNA'nın kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizmi gnotobiyotik durumu doğrulamak için kullanılabilir. Gnotobiyotik hamamböceği sentetik veya ksenobiyotik mikrobiyal topluluklarla aşılanabilir.
Bu özel iş akışı yeni olsa da, gnotobiyotik hamamböceği kullanan önceki çalışmalar, sosyal davranışları, bağırsak sağlığını ve böcek konakçılarının bağışıklığını şekillendirmede bağırsak mikrobiyom montajı ve mikrobiyal roller hakkında fikir üretmiştir.
