O protocolo de geração de baratas gnotobióticas facilita o teste do impacto da remoção da comunidade microbiana intestinal nativa e substituição na saúde do hospedeiro e na montagem de microbiomas. Esta técnica utiliza métodos de múltiplas fontes para formar um fluxo de trabalho coeso e simplificado para gerar baratas gnotobióticas sem o uso de equipamentos de laboratório especializados caros. Considerando as muitas partes móveis diferentes deste protocolo gnotobiótico, a visualização ajuda os pesquisadores a estabelecer mais facilmente suas próprias instalações gnotobióticas de pequena escala, de baixo custo e de bancada.
Para facilitar a coleta do número adequado de fêmeas que carregam oothecae para os experimentos planejados, use fórceps para mover os tubos de papelão contendo fêmeas gravid no tanque de estoque. Se um tubo de papelão contiver vários insetos, além da fêmea gravid, agite o conteúdo do tubo em um recipiente de plástico adicional anelado com geleia de petróleo e incentive o inseto alvo a voltar para o tubo de papelão sozinho. Após a coleta, transfira cada fêmea gravid para a maternidade.
Uma vez que as fêmeas tenham deixado cair o oothecae, devolva as fêmeas ao tanque de estoque e use fórceps para recuperar o oothecae da ninhada. Para limpar a oothecae, coloque até cinco caixas de ovos em um tubo de centrífuga de cinco mililitros contendo três mililitros de sulfato de dodecyl de sódio e vórtice da oothecae por 10 segundos. Depois de uma segunda lavagem como apenas demonstrado, use uma delicada limpeza de tarefa para esfregar suavemente a superfície de cada ootheca para remover quaisquer detritos e colocar a ootheca limpa em um barco de pesagem.
Antes da esterilização, encha dois tubos de centrífugas de 1,5 mililitro por ootheca com um mililitro de água estéril por tubo. Adicione também 10 microliters de 32% solução de estoque de ácido peracético a 3,2 mililitros de água dupla destilada em um tubo de centrífuga de cinco mililitros em um capô de fumaça. Cap e inverta várias vezes para misturar e colocar até cinco oothecae limpo na solução de ácido peracético recém-preparada de 0,1% por cinco minutos, invertendo o tubo várias vezes a cada 60 segundos.
O ácido peracético é um oxidante forte um olho, pele e irritante respiratório, e é inflamável e corrosivo. Use sempre o EPI adequado durante o manuseio e descarte seus resíduos adequadamente. No final da incubação, use fórceps estéreis e uma capa de fluxo laminar para transferir cada ootheca para seu próprio tubo centrífuga de água estéril de lavagem.
Inverta várias vezes para misturar antes de transferir a oothecae para o segundo conjunto de tubos de água enxágue. Após a segunda lavagem, use fórceps estéreis para transferir o oothecae para inclinações individuais de BHI. Coloque as inclinações em um recipiente secundário esterilizado e mova o recipiente para uma incubadora umidificada de 30 graus Celsius por quatro a cinco semanas até eclodir.
Verifique as inclinações regularmente de uma a duas vezes por semana para crescimento fúngico ou bacteriano até a quarta semana, momento em que as inclinações devem ser verificadas diariamente. Quando as ninfas começarem a eclodir, use fórceps estéreis e um capô de fluxo laminar para transferir asticamente uma pelota de comida de rato esterilizada para um frasco BHI preparado. Como uma verificação de esterilidade, coloque o frasco no recipiente secundário na incubadora de 30 graus Celsius por 24 horas para confirmar a falta de crescimento contaminante.
Se o frasco permaneceu estéril, agite as ninfas para fora da inclinação, deixando-as cair no frasco no capô de fluxo laminar. Em seguida, regar as ninfas com 300 microliters de água estéril uma vez por semana na capa de fluxo laminar. Quando as fezes de ninfa começarem a cobrir o piso médio, transfira as ninfas para um novo frasco BHI contendo comida de rato esterilizada adicionada com 24 horas de antecedência, como demonstrado.
As fêmeas grávidas podem ser identificadas pela ootheca presa ao abdômen posterior. O oothecae eclode uma média de 34 dias após a esterilização. Em casos de esterilização mal sucedida, o crescimento pode aparecer ao redor da oothecae durante a incubação, comprometendo o estado gnotobiótico dos filhotes.
Em seguida, a taxa de crescimento ninfa pode ser rastreada medindo o comprimento do corpo do inseto. O polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição do DNA ribossômico 16S de uma ninfa homogeneizada pode ser usado para confirmar o estado gnóbito. Baratas gnotobióticas podem ser inoculadas com comunidades microbianas sintéticas ou xenóbiticas.
Embora este fluxo de trabalho em particular seja novo, estudos anteriores usando baratas gnotobióticas geraram insights sobre a montagem de microbioma intestinal e papéis microbianos na formação do comportamento social, saúde intestinal e imunidade de seus hospedeiros de insetos.
