우리는 삽화 혜원 쿠퍼 감사합니다.

1. 해부 이 프로토콜에서 사용 바퀴벌레 식염수 용액은 다음 조성을 갖는다 : 바퀴벌레 식염수 36 : (100 ML에 대한 그램) 210 mM의 염화나트륨 (1.227 g) 2.9 밀리미터의 KCl (0.0216 g) 1.8 mM의 염화칼슘 (0.0265 g) 0.2 밀리미터의 NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0.0032 g) 1.8 밀리미터 나 2 HPO 4 • 7H 2 O (0.0483 g) (pH가 7.2. 1 M 수산화 나트륨 또는 1 M HCl로 산도를 조정). <ol><li> 강력한 cerci (그림 1)가 저장 탱크에서 남성 바퀴벌레를 선택합니다. 남성의 마지막 세그먼트는 여성에 비해 좁고, 그리고 난소와 산란 량 더를 포함하지 않는, 남성은 해부하기 쉽다. P.의 남성 아메리 cerci 사이의 짧은 스타일러스의 한 쌍있다. 이 스타일러스는 여성에서 관찰되지 않습니다. </li><li> 날개, 다리와 머리를 잘라 디에 몸 복부 측면을 위로, 핀쉬 실리콘 엘라스토머로 늘어서있다. </li><li> 집게는 복부 접시를 들고 뒤쪽 끝에서 시작하여 전방 작업, 미세 가위로 잘라와. cerci 건조하게 유지하는 동안 항상 식염수로 습기가 내부 장기를 유지합니다. 하나 cerci 습윤제에서 식염수를 방지하기 위해 복부 위쪽 위치를 왁스 또는 고무 조각을 사용할 수있다. 습한 경우, 조직 종이로 건조. 측면으로 내부 장기와 흰색 물질 (지방의 몸)을 밀어 넣습니다. VNC는 필드의 중앙에, 복부의 길이를 실행하고 반짝 tracheae 사이에 볼 수 있어야합니다. 신경 코드는 반투명이고, 처음에 조명 (그림 2) 적절하게 조절 될 때까지 확인하기 어려울 수 있습니다. 집게 또는 곤충 핀으로 VNC를 처리하지 않는 대신 유리 프로브를 사용하여 조작 할 수 있습니다. </li><li> 동물의 tracheae 시스템으로 최고의 집게로 신경 코드에서 가능한 한 정밀 유리 필요 한 쌍을 제거하다레는 매우 신중하게 길이 방향으로 A6와 A5 또는 A5와 A4 신경절 (그림 3) 사이의 VNC의 connectives을 분할. 요람 cerci 짧아 곤충 핀 왁스 또는 준비 (그림 4A 및 B)를 맞게 절단 할 수있는 실리콘 엘라스토머의 쐐기 식염수 목욕 중 위쪽 복부. 신경절에 투영 cercal 신경 손상을 방지하기 위해 마지막 복부 세그먼트에있는 여분의주의 (그림 2D 및 5). </li></ol> 2. 세포 외 기록 <ol><li> 해부 준비, 현미경 및 기록 장치 (그림 6) 신경 세포에서 신호를 재정의 할 수 있습니다 외부, 특히 AC, 전기장을 차단하는 패러데이 케이지 안에 설치해야합니다. </li><li> 그것은 현미경의 무대를 내려다되도록 현미경을 배치합니다. 제제가 스테이지에 배치되면, 고강도 일루미네이터 빔의 위치를​​ 조정그것의 가장 좋은 시각화를위한. </li><li> 통합 된 데이터 기록 장치에 AC / DC 차동 증폭기를 연결합니다 (특정 하드웨어 및 소프트웨어 설정에 대한 자세한 내용은 이전에 25를 설명했습니다). 흡입 전극을 들고 머리 단계는 앰프에 연결해야합니다. 망할 CIA에 코팅 된은 접지선 -보다 안정적인 레코딩 복부 결과에 삽입. 체강 내의 용액이 접시에 입욕 유체와 접촉, 기록 유지 전극이 접지에 연결된 유체가 아닌 경우 이유이다. </li><li> 4 kHz로 기록 주파수를 설정합니다. 500 MV (이것은 미량의 시각화를 최적화하도록 조정될 수있다)로 스케일 전압 (Y 축)을 설정한다. 자극에 반응하여 신경 활동을 기록하는 연속 또는 오실로스코프 모드에서 기록 소프트웨어를 실행. </li><li> A5에 가까운 VNC의 connectives 중 하나를 잘라 흡입 전극에 A6에 장착 된 단면을 배치합니다. 피하십시오신경에 흡입하기 전에 내부의 실버 와이어를 커버하는 흡입 전극에 날개 펼진 식염수. </li><li> 각 cercus에있는 머리카락에에 건조 피펫 타격 공기. 기록 결합에 cercus의 동측에 머리를 자극하면 반대측 아닌 다른 응답을 제공하는 경우를 참조하십시오. 응답의 진폭과 자극하는 동안 주어진 시간 간격에서 스파이크의 수를 적어 둡니다. </li><li> 녹음 cercal 신경에 흡입 전극을 이동합니다. 필요한 경우 작은 구멍에 전극의 끝 부분에 더 잘 맞는, 스위치를 얻을 수 있습니다. </li><li> A6에 cercal 신경 가까이 잘라 다음 cercus로 이어지는 신경을 빨아. 활동 전위의 자연 발화가 있어야합니다. 이제 cercus에 공기를 불어 응답을 확인합니다. </li></ol> 3. 전기 모집을 결정하는 감각 신경을 자극 <ol><li> 그것은 (100 ~ 500 MSE 흔적을 기록하도록 모드를 청소하는 레코딩 소프트웨어를 변경C.)마다 자극이 트리거됩니다. </li><li> 자극의 출력에 자극 전극을 연결합니다. </li><li> 두 개의 미니 후크 리드 나 클립을 자극 케이블을 연결합니다. </li><li> 기록 장치의 트리거 입력에 자극에서 BNC 트리거 출력을 연결합니다. </li><li> 10 밀리 초; 주파수 :; 재생 시간 : 지연 0.3 초​​ 다음 자극 파라미터는 응답 연상해야 1 Hz에서, 전압 : 레코딩에서 신호를 획득하기 위해 필요에 따라 (단지 임계치 이상 및 최대 반응을 얻을 수있는) 조정한다. 높은 전압이 신경에 손상을 입을 수로 채​​용을 위해 최대 임계 값보다 훨씬 높은 전압에 갈 이유가 없다. </li><li> 긴 신경근이 자극 흡입 전극에 (그림 7, 화살표 머리)를 뽑아 될 수 있도록 가능한 한 말단으로 cercal 신경을 잘라. A6와 A5 또는 다른 부분보다 전방 사이의 결합을 사용할 수 있습니다. </li><li> 기록 흡입 전극을 설정 할 수 있도록 PU전극에 컷 결합을거야. 신경에 흡입하기 전에 내부의 실버 와이어를 커버하는 흡입 전극에 식염수를 끌어해야합니다. 자극 전극도 (A3 근처의 복부에 이상적입니다) 목욕 식염수에 접지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 활동 전위는 화면에 표시 될 때까지 점증 전압의 하나의 자극의 시리즈를 전달한다. 하나는 응답을 보충하는 최소한의 자극의 전압과 시간의 기록을 확인해야합니다. connectives에서 시냅스 반응이 관찰 될 때까지 강도를 높입니다. 거대한 축삭에서 큰 스파이크 (세포 AP는) 먼저 표시 한 다음 다른 작은 AP의도 관찰 할 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Full, R. J., Tu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+rapid+running+insect:+two-,+four-+and+six-legged+locomotion.">Mechanics of a rapid running insect: two-, four- and six-legged locomotion.</a> J. Exp. Biol. 156, 215-231 (1991).</li><li>Ritzmann, R. E., Tobias, M. L., Fourtner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flight+activity+initiated+via+giant+interneurons+of+the+cockroach:+Evidence+for+bifunctional+trigger+interneurons.">Flight activity initiated via giant interneurons of the cockroach: Evidence for bifunctional trigger interneurons.</a> Science. 210, 443-445 (1980).</li><li>Libersat, F., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cercal+position+during+flight+in+the+cockroach:+a+mechanism+for+regulating+sensory+feedback.">Control of cercal position during flight in the cockroach: a mechanism for regulating sensory feedback.</a> J. Exp. Biol. 136, 483-488 (1988).</li><li>Ganihar, D., Libersat, F., Wendler, G., Cambi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wind-evoked+evasive+responses+in+flying+cockroaches.">Wind-evoked evasive responses in flying cockroaches.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 175, 49-65 (1994).</li><li>Pipa, R. a. D., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The American Cockroach. , 175-216 (1981).</li><li>Westin, J., Langberg, J. J., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+giant+interneurons+of+the+cockroach;+Periplaneta+americana+to+wind+puffs+of+different+directions+and+velocities.">Responses of giant interneurons of the cockroach; Periplaneta americana to wind puffs of different directions and velocities.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 121, 307-324 (1977).</li><li>Camhi, J. M., Tom, W., Volman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+escape+behavior+of+the+cockroach+Periplaneta+americana.">The escape behavior of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 128, 203-212 (1978).</li><li>Nicklaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Die+Erregung+einzelner+Fadenhaare+von+Periplaneta+americana+in+Abh&#228;ngigkeit+von+der+Gr&#246;sse+und+Richtung+der+Auslenkung.">Die Erregung einzelner Fadenhaare von Periplaneta americana in Abh&#228;ngigkeit von der Gr&#246;sse und Richtung der Auslenkung.</a> Z. Vgl. Physiol. 50, 331-362 (1965).</li><li>Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+to+wind+recorded+from+the+cercal+nerve+of+the+cockroach+Periplaneta+americana.">Responses to wind recorded from the cercal nerve of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 133, 97-102 (1979).</li><li>Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 93-131 (1984).</li><li>Ritzmann, R. E., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thoracic+interneurons+that+mediate+giant+interneuron-to-motor+pathways+in+the+cockroach.">Identification of thoracic interneurons that mediate giant interneuron-to-motor pathways in the cockroach.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 159, 639-654 (1986).</li><li>Plummer, M. R., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+sensory+signals+from+noise+in+the+escape+system+of+the+cockroach+-+the+role+of+wind+acceleration.">Discrimination of sensory signals from noise in the escape system of the cockroach - the role of wind acceleration.</a> J. Comp. Physiol. 142, 347-357 (1981).</li><li>Bullock, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neural Mechanisms of Startle Behavior. , 1-14 (1984).</li><li>Pollack, A. J., Ritzmann, R. E., Watson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pathways+for+tactile+sensory+information+to+thoracic+interneurons+in+the+cockroach.">Dual pathways for tactile sensory information to thoracic interneurons in the cockroach.</a> J. Neurobiol. 26, 33-46 (1995).</li><li>Atwood, H. L., Wiersma, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Command+interneurons+in+the+crayfish+central+nervous+system.">Command interneurons in the crayfish central nervous system.</a> J. Exp. Biol. 46, 249-261 (1967).</li><li>Olson, G. C., Krasne, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crayfish+lateral+giants+as+command+neurons+for+escape+behavior.">The crayfish lateral giants as command neurons for escape behavior.</a> Brain Res. 214, 89-100 (1981).</li><li>Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cockroach+escape+behavior+with+lesions+of+individual+giant+interneurons.">Analyzing cockroach escape behavior with lesions of individual giant interneurons.</a> Brain Res. 335, 342-346 (1985).</li><li>Comer, C. M., Dowd, J. P., Stubblefield, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+responses+following+elimination+of+the+giant+interneuron+pathway+in+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Escape responses following elimination of the giant interneuron pathway in the cockroach, Periplaneta americana.</a> Brain Res. 445, 370-375 (1988).</li><li>Keegan, A. P., Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wind-elicited+escape+response+of+cockroaches+(Periplaneta+americana)+is+influenced+by+lesions+rostral+to+the+escape+circuit.">The wind-elicited escape response of cockroaches (Periplaneta americana) is influenced by lesions rostral to the escape circuit.</a> Brain Res. 620, 310-316 (1993).</li><li>Casagrand, J. L., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenic+amines+modulate+synaptic+transmission+between+identified+giant+interneurons+and+thoracic+interneurons+in+the+escape+system+of+the+cockroach.">Biogenic amines modulate synaptic transmission between identified giant interneurons and thoracic interneurons in the escape system of the cockroach.</a> J. Neurobiol. 23, 644-655 (1992).</li><li>Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+ascending+giant+fiber+system+in+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Organization of the ascending giant fiber system in the cockroach, Periplaneta americana.</a> J. Exp. Zool. 108, 243-261 (1948).</li><li>Ramos, R. L., Moiseff, A., Brumberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+and+versatility+of+extracellular+recordings+from+the+cockroach+for+neurophysiological+instruction+and+demonstration.">Utility and versatility of extracellular recordings from the cockroach for neurophysiological instruction and demonstration.</a> J. Undergrad. Neurosci. Educ. 5, (2007).</li><li>Oakley, B., Schafer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+neurobiology.">Experimental neurobiology.</a> , (1978).</li><li>Welsh, J. H., Smith, R. I., Kammer, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory exercises in invertebrate physiology. , (1968).</li><li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen:+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception.">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).</li><li>Bacon, J. P., Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+sensory+neurons+in+mutant+cockroaches+compete+with+normal+cells+for+central+targets.">Ectopic sensory neurons in mutant cockroaches compete with normal cells for central targets.</a> Development. 115, 773-784 (1992).</li><li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-factors+and+co-repressors+of+Engrailed:+expression+in+the+central+nervous+system+and+cerci+of+the+cockroach,+Periplaneta+americana.">Co-factors and co-repressors of Engrailed: expression in the central nervous system and cerci of the cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tiss. Res. 327, 177-187 (2007).</li><li>Blagburn, J. M., Gibbon, C. R., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+engrailed+in+an+array+of+identified+sensory+neurons:+comparison+with+position,+axonal+arborization,+and+synaptic+connectivity.">Expression of engrailed in an array of identified sensory neurons: comparison with position, axonal arborization, and synaptic connectivity.</a> J. Neurobiol. 28, 493-505 (1995).</li><li>Booth, D., Marie, B., Domenici, P., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+control+of+behavior:+engrailed+knock-out+changes+cockroach+escape+trajectories.">Transcriptional control of behavior: engrailed knock-out changes cockroach escape trajectories.</a> J. Neurosci. 29, 7181-7190 (2009).</li><li>Schrader, S., Horseman, G., Cokl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+sensitivity+of+wind-sensitive+giant+interneurons+in+the+cave+cricket+Troglophilus+neglectus.">Directional sensitivity of wind-sensitive giant interneurons in the cave cricket Troglophilus neglectus.</a> J. Exp. Zool. 292, 73-81 (2002).</li><li>Libersat, F., Goldstein, R. S., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsynaptic+regulation+of+sensory+activity+during+movement+in+cockroaches.">Nonsynaptic regulation of sensory activity during movement in cockroaches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8150-8154 (1987).</li><li>Stern, M., Ediger, V. L., Gibbon, C. R., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cercal+filiform+hair+sensory+neurons+in+the+first-instar+cockroach+restores+escape+behavior.">Regeneration of cercal filiform hair sensory neurons in the first-instar cockroach restores escape behavior.</a> J. Neurobiol. 33, 439-458 (1997).</li><li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+specificity+in+the+first+instar+cockroach:+patterns+of+monosynaptic+input+from+filiform+hair+afferents+to+giant+interneurons.">Synaptic specificity in the first instar cockroach: patterns of monosynaptic input from filiform hair afferents to giant interneurons.</a> J. Comp. Physiol A. 166, 133-142 (1989).</li><li>Watanabe, H., Ai, H., Yokohari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+activity+patterns+of+odor-induced+synchronized+potentials+revealed+by+voltage-sensitive+dye+imaging+and+intracellular+recording+in+the+antennal+lobe+of+the+cockroach.">Spatio-temporal activity patterns of odor-induced synchronized potentials revealed by voltage-sensitive dye imaging and intracellular recording in the antennal lobe of the cockroach.</a> Front. Sys. Neurosci. (6), 55 (2012).</li><li>Nishino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+and+olfactory+input+segregation+in+the+mushroom+body+calyces+in+a+basal+neopteran,+the+American+cockroach.">Visual and olfactory input segregation in the mushroom body calyces in a basal neopteran, the American cockroach.</a> Arthropod Struct. Dev. 41, 3-16 (2012).</li><li>Elia, A. J., Gardner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+DDT+on+the+behavior+and+central+nervous+system+activity+in+Periplaneta+americana.">Long-term effects of DDT on the behavior and central nervous system activity in Periplaneta americana.</a> Pestic. Biochem. Physiol. 21, 326-335 (1984).</li></ol>

저자는 이익의 충돌이 없음을 선언합니다.

이 고전적인 제조에 대하여 기술을 나타내는 이유 중의 하나는 cerci 시스템되었음을이며 여전히 신경 회로의 개발의 문제를 해결뿐만 아니라 시냅스 수리 및 재생 26-31 질문에 대한 연구의 활성 영역이다. 바퀴벌레 복부 신경 코드의 활동을 되살리는의 두 방법 모두 신경계 기능에 약리학 제 또는 살충제의 영향을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 실험은 단순히 식염수로 신경 활성 화학 물질을 용해하여 수행됩니다. CNS 기능에 대한 화학 물질의 효과의 일관된 판독을 제공하는 connectives 또는 운동 신경에서 기록하는 동안 일반 목욕 ​​매체로이 솔루션을 교환 한 후, 유발 또는 자발적인 활동의 변화를 관찰 할 수있다. 모든 신경 생리 학적 실험에서와 마찬가지로 일반적인 문제는 전기 노이즈입니다. 이러한 준비에 대한 신호 품질에 아마도 가장 큰 요인 I신경 조직에 관련된 흡입 전극 실. 완전히 cercal 신경 또는 결합에 그려지지 않는 단단한 물개가 이상적입니다. 레코딩은 또한 신경 코드 및 미네랄 오일 및 바셀린의 혼합물과 VNC 절연막하에 넣었다 이중 훅 전극으로 이루어질 수있다. 혼합물을 주사기로로드 및 신경 코드 (32)의 주위에 배출 될 수있다. 또한주의 절개는 CNS의 준비로 여기로 중요합니다. 일부는 쉽게 지느러미 표피를 해부하여 CNS에 액세스 할 찾을 수 있습니다. 이것은 복부 신경 코드의 손상의 가능성을 감소하면서,이 방법을 이용하여 내장을 모두 제거하는 것이 더 어려울 수있다. 그것은 여기에 설명되지 않고,이 혼합물은 거인의 interneurons (32, 33)의 세포 내 기록에 대한 의무입니다. 전체 신경 코드는 동시에 여러 기록 및 자극 전극을 수용하기 위해 제거 될 수있다. 더듬이 로브, 버섯 보의 사실 탐사DY 및 기타 전방 CNS의 구조는 진행 34 ~ 35에 아직도있다. 바퀴벌레 CNS는 현대 신경 생물학 연구에 빛을 발산하기 위해 계속하는 동안이 특별한 준비는 학부 대학 실험실에서 사용하기에 충분한 간단합니다.

거기에 4,000 개 이상의 바퀴벌레 종은 만 30 가정용 해충이다. 아마도 가장 인정 아프리카에서 유래 이름을 잘못 부른 미국의 바퀴벌레 Periplaneta 아메리이며, 지금은 거의 모든 곳에서 지구상에서 발견된다. 열대의 빠른 실행 속도 1과 회피 행동 외에도 P. 아메리 비행 2,3 할 수있다. 바퀴벌레 중추 신경계 (CNS)의 주된 특성은 컨트롤의 분할 자연과 지방 분권은 4,5를 처리합니다. 뇌, 흉부, 복부 신경은 복부 신경 코드 (VNC)을 형성 한 쌍이 절간 connectives에 의해 함께 결합된다. 각 세그먼트의 신경이 센터를 통합하고 있습니다. 그들은 그들 아래 뇌 혈관 투과성 배리어에 대해 책임 세포를 포함하는 외측 피질 영역 및 뉴런 origi의 인 somata 구성된다그 신경절에 출력용 스위치. 이러한 인 somata은의 interneurons, 조절 성 신경 또는 운동 신경에 속할 수 있습니다. 그들은 원산지 (지역 interneuron의)의 신경절 내에서 유지 축삭, 또는 CNS (절간의 interneurons)의 신경 또는 그 주변 근육 세포 (운동 뉴런)에 종료 사이에 프로젝트 축삭을 공급한다. 대부분의 인 somata은 신경절 피질 5 배쪽으로 또는 ventrolaterally 위치한다. 쌍, 절간 connectives은 축삭없이 신경 세포 기관을 포함한다. 신경절의 neuropil는 아교 세포 (neuroglia), 축삭 책자, 축삭의 번들 및 신경 세포의 수상 돌기 (신경 돌기)가 포함되어 있습니다. neuropil는 신경 세포 기관은없는 것입니다. 이 신경 세포와 입력 통합 간의 직접적인 통신이 발생할 시냅스 신경절 내의 영역이다. 미국 바퀴벌레 P.의 능력 (발, 한을 감지하고 갑자기 접근하는 포식자에 대응하기 아메리D, 등.) cerci 거대한 섬유 시스템 6,7로 구성된 반사 회로에 기인하고있다. cerci 복부의 끝 (그림 1)에있는 뿔처럼, 바람에 민감한 구조의 쌍입니다. P.에서 아메리 각 cercus의 복부 표면은 약 200 사상 (실), 14 열으로 구성되어 머리카락이 포함되어 있습니다. 이러한 열의 아홉은 지속적으로 관련 수용체 세포와 축삭의 응답 특성에 따라 다른 동물에서 확인 할 수있다. 각 머리는 열 고유 한 평면에 가장 쉽게 구부릴 수있는 소켓입니다. 그 평면을 따라 한 방향으로 머리의 움직임 수용체 세포의 탈분극 및 감각 신경 세포에서 활동 전위의 버스트 (APS)을 유도한다. 반대 방향으로 운동이 진행중인 자연 AP에 8을 억제한다. 응답의 편향과 방향성의 바람직한면은 각 열에서 다릅니다. 따라서, filiform 머리 - 수용체 착물은 공기의 움직임을 검출하기위한 AP들뿐만 아니라, 공기 흐름이 시작된 방향의 형태로, &#39;코딩&#39;에 대한뿐만 책임진다. CNS하여이 정보의 처리는 &#39;적절한&#39;탈출 응답 6,7 발생합니다. 감각 머리카락이 기능, 원주, 특이도는 동물에서 동물로 유지됩니다. 각 사상 머리의 수용체 세포는 수용체 세포의 축삭 9 AP를 버스트 또는 억제의 결과로 신경 이벤트 (에 머리의 기계적 변형을 형질 도입에 대한 책임이 있습니다.의 AP는 cercal를 통해 터미널 복부 신경절 (A6)에 여행 그들은 복부 신경 코드 (VNC)의 거대한 축삭과 시냅스 신경 XI는. 거대한 축삭은 탈출 행동 6,10,11 결과 운동 신경의 전송 이후 여기에 대한 책임을 것으로 생각됩니다. 행동 대기 오P.의 탈출 응답 F 아메리 어떤 동물 (7)의 짧은 중 하나입니다. 행동 지연 mechanoreceptor에서 자극의 도착과 탈출 반응의 시작 사이의 시간입니다. 공격 두꺼비에서 시도 된 탈출을 기록하는 고속 촬영을 사용하여 실험에서 바퀴벌레가 이동 7,12 바퀴벌레 혀 확장의 시작에서 약 40 밀리 초 (시간 거리에 두꺼비에서의 회전을 시작하는 것으로 관찰되었다. 제어 바람 퍼프를 사용하여 , 행동 대기 시간이 11 밀리 초를 줄일 수있다. 다른 실험을하는 동안 더 낮은 속도 (3 월 / (밀리 600mm / 2의 가속도) / 밀리 12mm의 최소 바람 퍼프 속도가 탈출 반응을 불러 일으킬 수있는 것으로 나타났습니다 초) 천천히 12 이동을 중지하는 바퀴벌레 걷기가 발생했습니다. 일반적으로 거대한 섬유 시스템 및 탈출 행동 사이에 존재하는 강한 상관 관계가 아니라 13, 14을 기록하고있다. 이달의특정 셀이 필요하고 특정 동작을 연상시키기에 충분하다 동시에 사용은 셀 커맨드 뉴런 15,16이라고한다. P.의 바람 탈출 회로 거인의 interneurons (GIS) 아메리 반사에 필요하지 않습니다. 실험적으로 병사를 절제 한 동물은 여전히 탈출 행동 때문에 이러한 병사는 명령 뉴런 (17, 18)로 간주되지 않습니다을 나타낸다. 감각 회로 주동이 아르 자궁 connectives를 절단하는 것이 또한 뇌에서 입력을 내림차순 것은 이스케이프 (19)의 방향에 대한 효과가 있음을 나타내는 동작에 영향을 미친다. 미세 제어 및 이중화의 이러한 측면은 유기체의 생존에 중요하고 생체 아민 (20)을 통해 신경 화학적 변조에 의해 보완된다. P. 아메리 신경 코드의 준비는 위 Roeder &lt;의 선구적인 작업부터 시작하여 지난 수십 년에 걸쳐 neuroethologists에 대한 우아한 모델 시스템이다&gt; 21 일 저녁을 먹다. 그것은 그들의 입력 22,23,24에 거인의 interneurons로 기본 감각 활동과 그 결과 응답을 기록, 표시 및 분석 할 학생들을 허용합니다. 식별 신경 회로가 환경에 대한 행동 반응의 기초가 있다는 생각을 전달하는 것 외에도,이 운동이 일반 가정 해충에 의해 생물학적 기여 감사를 주입해야합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

바퀴벌레 복부 신경 코드 준비 neuroethology 실험, 뉴럴 네트워크 모델링 및 살충제의 생리적 효과를 테스트하기위한 시스템에 온순하다. 이 문서에서는 곤충 신경계 환경 교란에 응답하는 방법을 분석 실험하는 데 사용할 수있는 바퀴벌레의 감각 양식의 범위를 설명합니다. 여기에서 강조 Periplaneta 아메리의 거대한 섬유 전송에 cerci에 의해 매개 탈출 행동입니다. 이 현장 준비에 신경 활동의 재현 기록을 생성하는 유일한 적당한 해부 기술과 전기 생리학 전문 지식을 필요로합니다. 펩티드 또는 다른 화학 시약은 생리 식염수 용액에 신경 시스템에 직접 적용 할 수있다. 살충제는 해부하기 전에 투여 될 수 있고 탈출 회​​로는 중추 신경계의 흥분성 상태 프록시 역할을 할 수있다. 이러한 맥락에서 본원에 기재된 분석법은 또한 R에 유용 할 것이다사지의 재생 및 신경 시스템 개발의 진화에 관심이 esearchers하는 대한 P. 아메리 설립 모델 생물이다.

공기의 퍼프로 cerci에 털이 자극 중 하나 복부 신경절 또는 cercal 신경 자체 (그림 8) 사이 connectives에 부착 된 세포 흡입 전극을 사용하여 기록 할 수있는 기본 감각 뉴런의 방전의 원인이됩니다. 두 지역에서 기록 스파이크 진폭 밀리 볼트에 몇 마이크로 볼트의 순서에 있습니다. 때문에 신경절의 감각 통합의 복합 활동 전위 또는 cercal 신경으로부터 기록 개별 스파이크로서 관찰 스파이크의 개수는 connectives로부터 녹음 관찰보다 현저하게 크다. 그러나 인해 전극과 신경 조직 사이의 긴밀한 씰 결합의 기록에 실질적으로 더 적은 소음이 있습니다. cerci 큰 스파이크에 공기를 내뿜는으로 connectives (그림 8A)에서 관찰 할 수있다. 이 자극 방법을 사용하여, A3 및 A4 간의 레코딩 전형적인<html> LY 거대한 interneuron의 (들)의 큰 스파이크 특성을 보여줍니다. 물리적으로 집게로 cerci을 마찰하면서 cercal 신경에서 녹음 활동의 강한 버스트 (그림 (b) 1) 생산. 다른 기록에서, 공기의 2 퍼프는 각각 cercal 신경의 급격한 파열 응답 (그림 (b) 2) 생산. 전기 A3와 A4 사이의 결합에 흡입 전극과 녹음 cercal 신경을 자극하면, 하나는 (그림 8C 1) 반응을 유발하는 자극에 임계 값을 관찰 할 수 있습니다. cercal 신경의 전기 자극은 명확하게, 온도 등의 약리 대리인 또는 지역의 환경은 주변과 속임수 공부를 정량화 할 수 connectives의 응답 (그림 8C 2)를 이끌어 낸다. <html> fig1.jpg &quot;/&gt; 그대로 cerci 그림 1. Periplaneta 아메리. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> 그림 2. 제거 복부 표피와 같이 바퀴벌레 신경 코드의 복부보기 (A). 화살표로 설명 된 세그먼트의 확대는 (B)에서 볼 수있다. (C)에서 connectives은 유리 프로브 A4 및 A3 사이에 엎질러 하였다. 6 회 복부 신경절은 두 cercal 신경 꼬리 끝에서 떠나와 (D)에 표시됩니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> 그림 3. 바퀴벌레 신경 코드의 회로도 복부보기. YS &quot;&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> 그림 4. cerci은 식염수 목욕 중 위쪽으로 배치됩니다. 열린 복부 밖으로 cerci을 유지하기 위해 실리콘 엘라스토머의 작은 쐐기 모양의 조각으로 상승되는 바퀴벌레의 꼬리 끝 식염수 (A)와 홍수 할 수 있습니다 목욕의 (B). <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> 그림 5. (화살표로 설명) cercal 신경과 제 6 회 복부 신경절. <img alt="그림 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> 그림 6. 장비를 설정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">고맙다을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>GER 그림입니다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> 그림 7. 자극과 기록 전극을 설정합니다. <img alt="그림 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> 그림 8. 다양한 자극 절차에 connectives 및 cercal 신경의 신경 녹음. cerci에 공기를 내뿜는 동안 A3와 A4의 connectives에서 흡입 전극과 기록 (A). 물리적으로 (B 1) 마찰이나 cercal 신경 활동의 빠른 버스트 에어 퍼프 (B 2) 결과를 제공하거나 동안 흡입 전극과 기본 cercal 뉴런에서 기록. 전기 cercal 신경을 자극하는 (connectives에서 응답을 생성 <strong&gt; C 1). 자극 강도의 점진적인 증가 (화살표는 자극 인공물의 진폭을 나타낸다)와 다음 유발 반응의 강도를 참고. cercal 신경의 전기 자극은 응답 (C 2) 정량 자극의 일관성에 대한 cercal 신경을 자극 상대적으로 더 많은 제어 방법을 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System at JoVE.com

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

이 문서에서는 바퀴벌레 복부 신경 코드 해부 cercal 신경과 connectives에서 세포 녹음을 설명합니다. 유발 반응은 cercal 신경 또는 cerci 직접 기계적 자극의 전기 자극에 의​​해 생성됩니다.

신경 회로 녹화 본래대로 바퀴벌레 신경계에서

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.1K 조회수.  University of Kentucky.  이 문서에서는 바퀴벌레 복부 신경 코드 해부 cercal 신경과 connectives에서 세포 녹음을 설명합니다. 유발 반응은 cercal 신경 또는 cerci 직접 기계적 자극의 전기 자극에 의​​해 생성됩니다. 

비디오: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

연구

신경과학

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

신경 응답을 녹음하고 추적하는 주사에 대한 깨어 마우스의 작성

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

신경 시스템 재구성, 변조 및 모델링을 위해 해부학 적으로 영감을받은 3 차원 미세 조직 공학 신경 회로망

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.