우리는 작은 RNA 시퀀싱및 오픈 소스 생물 정보학 도구를 사용하여 정규화 된 읽기를 분석하기위한 정의, 재현 가능, 오랜 프로토콜을 개발했습니다. 우리의 전략의 주요 장점은 젤 정화를 통해 microRNA를 정확하게 수집하고 생물 정보학 분석은 microRNA수집 방법에 관계없이 적용될 수 있다는 것입니다. microRNA의 높은 처리량 순서는 질병 기계장치에 대한 통찰력을 드러낼 수 있습니다, microRNA의 처리, 및 작은 RNA를 전달하는 유전자 치료 접근의 정확한 정량화.
RNase 무료 환경에서 작업하고 절차 전반에 걸쳐 모든 RNA 제품을 얼음에 보관하십시오. 젤 절삭 단계를 시각화하면 시청자가 다운스트림 응용 프로그램에 필요한 제품의 정확한 크기를 식별하는 데 도움이 됩니다. 3개의 프라임 어댑터 결찰의 경우, 11마이크로리터의 RNA와 ATP 무료 10X T4RNA 리구아제 반응 버퍼, 폴리에틸렌 글리콜1마이크로리터, 3개의 프라임 링커의 0.5 마이크로리터를 결합한다.
시료를 온도 순환기에서 섭씨 95도에서 30~40초 동안 가열한 다음 1분간 얼음 위를 냉각합니다. T4RNA 리간슬 2의 마이크로리터 1개를 추가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 시료가 인큐베이팅되는 동안 플라스틱 주조에 0.8mm 분리 유리 판 사이에 15% 폴리아시릴마이드 젤을 붓고 빗을 삽입합니다.
젤이 고화되면 탱크에 0.5 5X TBE를 넣고 파이펫을 적극적으로 추가하여 잔류 우레아의 우물을 씻으실 수 있습니다. 375볼트에서 25분 동안 폴리아크릴아미드 젤을 사전 실행한 후 샘플을 적재하여 각 샘플 사이에 적어도 하나의 레인을 남깁니다. 겔 방향을 추적하고 일정한 375 볼트에서 젤을 실행하기 위해 비대칭 패턴으로 적어도 두 세트의 마커 20 마이크로리터를 적재합니다.
15 분 후, 실행의 나머지 부분에 대한 일정한 425 볼트로 증가하고 약 2 시간 동안 젤을 실행합니다. 실행의 끝에서, 유리 판에서 젤을 제거하고 플라스틱 페이지 보호자에 젤을 배치 플레이트 분리기를 사용합니다. 증류수 500마이크로리터에 에티듐 브로마이드 5마이크로리터를 희석하고 상단 라이트 블루 마커 바로 위에 있는 마커 레인에 염료를 추가합니다.
다음으로, 깨끗한 면도날을 사용하여 자외선 아래 각 차선의 상부에서 아래 마커로 젤을 자르고 조각을 실험실 밀봉 필름의 4센티미터 사각형으로 옮춥니다. 약 3개의 컷으로 젤을 수평으로 자르고 2개의 컷을 수직으로 잘라 12개의 작은 사각형을 생산합니다. 밀봉 필름에 0.3 개의 어금니 나트륨 염화 나트륨 400 마이크로 리터를 추가하고 젤 조각을 1.5 밀리리터 실리콘 튜브로 안내합니다.
하룻밤 사이에 4도에서 영양가에 샘플을 동요. 다음 날 아침, 각 상체의 400 마이크로리터를 새로운 튜브로 옮킨다. 1밀리리터 100%에탄올과 15밀리리터당 1밀리리터를 튜브당 글리코겐 공동 침전제를 넣으세요.
그런 다음 튜브를 영하 80도에서 1시간 동안 보관합니다. 5개의 프라임 링커 결찰의 경우 먼저 해동된 샘플을 스핀다운하고 물 에서 펠릿을 다시 중단합니다. 다음으로, 100 마이크로몰라 5개의 프라임 링커, T4RNA 리구아제 버퍼 1개, 10밀리몰러 ATP의 마이크로리터 1개, 각 샘플에 폴리에틸렌 글리콜 1개의 마이크로리터를 0.5 마이크로리터를 추가합니다.
반응을 섭씨 90도에서 30초 동안 가열한 후 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 각 튜브에 T4RNA 리갈아제 1마이크로리터를 추가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 역전사의 경우, 원심분리에 의해 샘플을 수집하고 뉴클레아제 자유물의 8.25 마이크로리터에서 공기 건조 펠릿을 재연한다.
보완 DNA 합성 키트에서 100 마이크로몰라 역 전사 프라이머와 2X 역 전사 반응 믹스의 5 개의 마이크로 리터의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 42도에서 3분 후, 각 샘플에 10X 역전사 효소 1.5마이크로리터를 넣고 온도순환기에서 섭씨 42도에서 30분 간 배양합니다. 중화 후, 29.5 마이크로리터의 물, 10X 타크 버퍼5개, 뉴클레오시드 삼위상염 1마이크로리터, 25마이크로몰러 포워드 프라이머 25마이크로리터, 25마이크로몰라 역프라이머 25마이크로리터, taq 폴리머및 10개의 미량리터를 사용하여 PCR 반응을 준비한다.
그런 다음 두 개의 PCR 반응을 실행합니다. 아가로즈 젤 정제를 위해, 4%아가로즈 젤을 낮은 녹는 아가로즈로 준비하고 40 마이크로리터 이상을 적재하여 염색염과 100개의 베이스 페어 및 25개의 베이스 쌍 크기 마커를 젤에 적재한다. 젤을 실행한 후 125개의 베이스 페어 밴드 위에 밴드를 자르고 제조업체의 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용하십시오.
적절한 장비를 사용하기 전에 실온에서 젤 밴드를 버퍼로 녹여 최종 시퀀스 라이브러리를 정량화합니다. 그런 다음 적절한 오픈소스 생물정보학 도구를 사용하여 서열 데이터를 분석합니다. 이러한 대표적인 PCR 반응에서 저융 아가로즈 젤에 대한 반응에서는, 얻어진 링커 링커 제품 및 포화 시료 대비 불포화에 비해 올바른 복제 제품의 획득을 관찰할 수 있다.
인간 microRNA 헤어핀에 정렬 한 후, 각 복제에서 microRNA 판독 카운트 사이의 강한 일치를 관찰 할 수 있습니다. 총 306개의 마이크로RNA 종은 마이크로RNA 122에 매핑하는 가장 많은 수의 판독으로 검출되었다. microRNA의 정확한 복구를 가능하게 하기 위하여 적당한 크기로 젤을 잘라내는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
microRNAs를 시퀀싱한 후, 사용자는 생물정보학 분석을 적용하여 관심 있는 조직 내에서 microRNA의 분포를 특성화할 수 있습니다. 이 기술은 microRNA가 어떻게 처리되는지 그리고 특정 암에서 어떤 microRNA 세트가 변경되는지 를 확인하기 위하여 이용되었습니다. 에티듐 브로마이드를 다룰 때와 자외선 아래에서 젤을 볼 때주의하십시오.
