이 프로토콜을 사용하면 2차원 이미지에서 세포 내 구조의 영역, 둘레 및 모양을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 빠르고 쉽고 표준 실험실 설정과 공초점 현미경만 필요하며 오픈 소스 소프트웨어를 사용합니다. 절차를 시연하는 것은 안나 발세락, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다.
4웰 콜라겐 1코팅 챔버 슬라이드에서 잘 배양 배지의 0.5 밀리리터에서 5번째 세포에 4회 10번 을 시드하여 섭씨 37도 및 이산화탄소 인큐베이터 5도에서 24시간 배양한다. 다음 날 아침, 광학 반전 현미경을 사용하여 최소 90% 이상의 컨컬리 단층의 존재를 확인하고 공초점 현미경을 사용하여 단일 Z 슬라이스 이미지를 얻습니다. 초점 접착 해석의 경우 ImageJ에서 이미지를 열고 분석, 설정 축척, 스케일 제거 및 전역을 선택하여 이미지 배율을 픽셀단위로 설정합니다.
측정 옵션에 대한 파일 이름과 관심 영역영역을 포함하려면 측정을 분석하고 설정하고 영역을 확인하고 라벨 옵션을 표시합니다. 배경을 빼려면 프로세스를 선택하고 배경을 뺍니다. 롤링 볼 반경을 50픽셀로 설정하고 슬라이딩 포물선형을 확인합니다.
관심 영역의 가장 작은 영역을 확인하려면 가장 작은 단일 초점 접착을 설명하고 분석 및 측정을 클릭하여 영역을 측정합니다. 최소 20개의 관심 영역이 선택 및 측정된 경우, 획득된 결과의 평균을 계산하고 저장합니다. 상반신경계를 일반적인 셀 영역의 25%로 설정합니다.
이미지를 바이너리로 연결하려면 이미지를 클릭하고 조정 및 임계값을 클릭하고 기본값, 흑백 및 어두운 배경을 확인합니다. 관심 영역의 수와 영역을 측정하려면 파티클을 분석하고 분석하고 픽셀 단위를 확인하고 결과를 표시하고 결과를 지우고 요약합니다. 조각, 개수 및 총 면적 평균 크기 데이터를 요약 창에서 선택한 데이터 관리 프로그램으로 전송합니다.
초점 접착 정량화를 위해 초점 접착 ImageJ 매크로를 열고 가장 작은 관심 영역의 영역인 관심 영역의 영역으로 입력합니다. 임계값 유형 값을 수동 또는 자동값으로 설정하고 변경 내용을 저장합니다. 그런 다음 ImageJ에서 매크로를 호출하고 처리할 이미지를 선택합니다.
수동 셀 형상 해석의 경우 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고 측정할 매개 변수를 선택합니다. 프리핸드 선택 도구를 사용하여 선택되는 접합 단백질로 셀 테두리를 수동으로 설명합니다. 선택한 매개 변수는 각 셀에 대해 자동으로 계산됩니다.
모든 셀이 설명되면 편집, 선택 및 관리자에 추가합니다. 중단없는 테두리가 있는 완전히 보이는 셀만 선택해야 합니다. 측정을 하려면 관심 관리자 영역의 왼쪽 상자에 나타나는 모든 숫자를 표시하고 측정을 클릭합니다.
결과는 결과 상자에 표시되며 선택한 스프레드시트로 가져올 수 있습니다. 자동화된 세포 분석은 많은 수의 세포의 정량화를 용이하게 합니다. 모든 새 셀 유형에 대해 먼저 매크로를 실행하여 매개 변수를 설정합니다.
매크로가 완료되면 셀 크기 경계를 설정합니다. 가장 작고 가장 큰 셀의 레이블을 클릭하고 측정값을 클릭합니다. 가장 작은 셀과 가장 큰 셀 변수의 값을 설정하고 변경 내용을 저장합니다.
매크로 창을 모두 닫고 회색 조율로 처리할 이미지를 선택합니다. 그런 다음 매크로를 다시 실행합니다. 매크로는 셀 모양 인덱스, 종횡비 및 관심 영역 목록 데이터를 포함하는 결과 테이블을 제공합니다.
여기서, 대조군과 녹다운 세포주 모두에 대한 원본 이미지와 함께 최종 번호가 매겨진 윤곽선 및 초점 접착 윤곽의 오버레이를 포함하여 ImageJ로 계산된 초점 접착의 대표적인 이미지를 관찰할 수 있다. 이 분석에 도시된 바와 같이, 녹다운 세포는 세포세포 조절에 비해 크기가 큰 접착력뿐만 아니라 세포당 더 많은 수의 접착력을 보여 주었다. 이러한 이미지에서, 치료되지 않은 및 화학요법 처리된 세포 단층의 대표적인 영역이 표시됩니다.
윤곽도 세포는 그들의 세포 모양 인덱스 값에 따라 특징지어졌으며, 예를 들어 이 분석에서는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 약물 처리 된 세포에 대한 마지막 빈및 주요 피크의 평탄화의 증가를 보여주는 분석. 그런 다음 각 세포 배양에 대해 주파수 분포및 누적 분포를 생성할 수 있습니다. 단층의 그레이스케일 이미징은 12개의 시야에서 512개의 세포의 분석 및 정량화를 허용하여 세포 형상 지수의 상대주파수 분포를 드러냈다.
이 프로토콜이 작동하려면 최상의 품질의 이미지를 사용하는 것이 중요합니다. 적절한 세포 파종, 염색 및 이미징은 충분한 실험 품질의 이미지를 보장해야 합니다.
