상하이 9대 인민병원의 두개안면 이상에 대한 디지털화된 스토마토로지 연구센터의 도움을 주셔서 감사합니다. 이 원고의 작품은 중국 국립 자연과학재단(NSFC)[81570950,81870740,81800949]의 보조금으로 지원되고, 상하이 서밋 & 고원 분야, 상하이 정밀 의학 연구소, 상하이 9인조 병원, 상하이 자오동 의과대학 [JC201809], 상하이 자오동 대학 의과대학 고원혁신팀 인센티브 프로젝트. L.J.는 우수 청소년 의료 인재, 상하이 "의학 재능의 떠오르는 별" 청소년 개발 프로그램 및 상하이 자오퉁 대학의 "첸 싱" 프로젝트의 학자입니다.

이 논문의 모든 동물 실험 절차는 상하이 제9인민병원, 상하이 자오동 대학교 의과대학의 동물관리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 준비
<ol><li>실험에 대 한 두 5 주 된 남성 스프라 그 다울리 쥐를 사용.</li>
	<li>바늘 홀더, 핀셋 및 가위를 포함한 모든 계측기를 고온에서 살균하거나 75% 에탄올에 10분 동안 침지합니다. 참고: 에탄올 침수가 세포 손상을 피하기에는 너무 길어서는 안 됩니다.</li>
	<li>문화 매체를 미리 준비하며, 구성은 표 1에제공된다. 아래에 설명된 대로 각 매체를 보충하십시오.<ol>
<li>α-MEM 배양 배지(10% FBS) 제제: 최소 필수 중간 알파(α-MEM)를 10% 태아소 혈청과 1% 페니실린 및 연쇄절제술을 보충합니다.</li>
		<li>골성 분화 배지 의 준비: 10% 태아 소 혈청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.20% 아스코르브산, 1% β-글리페로포산 및 0.01% dexamethasone을 가진 보충 골성 분화 기저질 배지.</li>
		<li>골성 유도 매체의 준비: 혼합 70% α-MEM 배양 배지 (와 10% FBS) 및 30% 골성 분화 매체.</li>
		<li>아디포겐성 분화 매체 A: 10% 태아소 혈청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-연쇄절제술, 0.20% 인슐린, 0.10% IBMX, 0.10% 로시글리타존, 0.01% Dexamhasone.</li>
		<li>adipogenic 분화 매체 B의 준비: 보충 adipogenic 분화 기저 배지 와 10% 태아 소 혈 청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-연쇄 절제술 및 0.20% 인슐린.</li>
		<li>연골분균 분화 배지: 보충 연골분화 기저질 배지 0.01% 덱사메타손, 0.30% 아스코르브산, 1% ITS, 0.10% 피루바테 나트륨, 0.10% 프롤린, 1% TGF-β3. 참고: 골성 분화 배지는 구성 후 한 달 이내에 사용해야 합니다. 구성된 연골생성 분화 배지의 유효 기간은 12h이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 쥐 mBMSC의 격리 및 재배
참고: 모든 실험 작업은 세포 생존가능성을 유지하기 위해 가능한 한 얼음에서 수행해야 합니다.
<ol><li>수확 쥐 하악<ol>
<li>CO2 질식에 의해 두 5 주 된 남성 스프라그 Dawley 쥐를 안락사. 실험을 진행하기 전에 동물의 호흡이 멈추는지 확인합니다.</li>
		<li>3 분 동안 75 % 에탄올을 포함하는 비커에서 이 쥐를 헹구세요.</li>
		<li>쥐를 깨끗한 연기 후드 안에 놓고 하악을 수확합니다. 참고: 사용 전에 30분 동안 자외선으로 연기 후드를 살균하십시오.</li>
		<li>쥐를 척추 위치에 놓습니다. 피부와 부치네터 근육을 양자 간 통구 오리에서 하악의 후방 부위로 절개하여 절개를 낮은 유일한 이동 가능한 뼈입니다. 참고: 명확한 작동 필드를 얻기 위해 귤 오리스의 각 측면에 2cm 절개를 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>양 엄지 손가락으로 양상악절 절개를 반대 방향으로 밀어 쥐의 입을 열어 하악에 부착된 하악치아를 노출시다.</li>
		<li>코라코이드와 하악의 열등한 경계에 부착된 부칼 근육과 힘줄을 완전히 분리합니다. 참고: 근육 긴장의 부족 때문에 이 단계에서 하악의 증가 이동성이 관찰됩니다.</li>
		<li>양면의 콘딜레가 명확하게 드러나질 때까지 하악 후방 치아를 누르고 앞뒤로 회전합니다. 참고: 이 단계는 쥐의 입을 인위적으로 열어 콩딜을 탈구할 수 있는 최대 범위까지 수행된다. 하악은 양측 콘딜레를 통해 두개골에 연결되어 있으므로 condyles의 노출은 두개골과 하악 사이의 단절로 이어집니다.</li>
		<li>하악의 몸을 두개골과 분리합니다.</li>
		<li>젖은 거즈를 사용하여 뼈 표면에 부착 된 연조직을 청소하십시오.</li>
		<li>뼈를 10cm 멸균 유리 접시에 넣고 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 최소 필수 α(α-MEM) 또는 인산염 완충식식식(PBS)으로 채워져 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC의 격리 및 재배<ol>
<li>하악 몸에서 첫 번째 어금니의 매혹적인 가장자리를 따라 전방 뼈를 잘라. 골수 구멍을 노출하는 세 번째 어금니의 탈반 가장자리를 따라 코라코이드와 콘딜을 포함한 하악라무스를 제거합니다.</li>
		<li>10cm 멸균 유리 접시에 10mL의 α-MEM(10% FBS)을 채웁니다.</li>
		<li>1mL 주사기를 사용하여 α-MEM 배양 배지를 흡인하십시오. 주사기 바늘이 골수 구멍에 삽입되어 골수를 접시에 반복적으로 플러시합니다. 뼈가 하얗게 변할 때까지 뼈의 심미적 측면과 말단 측면에서 뼈 구멍을 3회 이상 플러시하십시오. 참고: 이것은 쥐 하악의 골수 구멍이 긴 뼈에서와 같이 명백하지 않기 때문에 가장 중요한 단계이며 바늘을 삽입하는 적절한 지점은 경험적으로 결정되어야합니다. 위의 모든 실험 샘플은 세포 생존가능성을 유지하기 위해 얼음에 저장되어야하므로 작동 시간이 2h 이상이어야합니다.</li>
		<li>플러시 된 세포를 포함하는 매체를 15 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 5 분 동안 4 °C에서 800 x g로 전송합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>α-MEM의 3mL로 세포를 다시 중단합니다(10% FBS). 새로운 10cm 배양 접시에 세포를 플레이트와 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배양.</li>
		<li>문화의 3 일에 이러한 세포의 형태학적 변화와 성장을 확인합니다. 비부착 세포 및 조직 단편으로 배양 배지를 제거합니다. 10% FBS를 통해 신선한 α-MEM 10mL를 부드럽게 추가합니다.</li>
		<li>문화 7일 간 P0 mBMSC는 70%에서 80%로 합류했습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플로우 셀 정렬 참고: P0 mBMSC는 유동 셀 분류를 통해 표기적으로 확인되고 주로 정제되었다.<ol>
<li>배양 매체를 흡인하고 폐기한 다음 PBS로 접시를 씻으십시오. PBS를 폐기합니다.</li>
		<li>요리에 0.02 % EDTA와 0.25 %의 트립신의 1 mL을 추가합니다. 세포를 37°C에서 5분 동안 소화한 다음, α-MEM 2mL(10% FBS)를 추가하여 반응을 중지합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브와 원심분리기로 5분 동안 800 x g로 옮긴다.</li>
		<li>원심 분리 후 PBS의 120 μL (10 % FBS)에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>15 분 동안 4 °C에서 CD16 / CD32에 대한 항체의 1 μL로 이러한 세포 현탁액을 차단하십시오.</li>
		<li>세포 현탁액의 100 μL을 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮기고, CD45에 대한 피코에리스린(PE)-컨쥬게이드 항체, CD90 및 알로피코시아니아닌(APC)-공주 항체에 대한 피코에리스린(PE)-컨쥬게이드 항체를 가진 세포를13,15에서1°C에 4°C로 염색하였다. 본 실험에 사용되는 항체의 농도는 표 2에도시된다. 다른 20 μL의 세포 현탁액을 얼룩지지 않은 음극으로 사용하십시오.</li>
		<li>그런 다음 5 분 동안 800 x g에서 튜브를 원심 분리하고 서스펜션을 폐기하고 PBS의 0.5 mL (10 % FBS)에서 세포를 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>분석 전에 10 분 동안 0.01 mg / mL DAPI의 10 μL을 추가합니다.</li>
		<li>원심분리기 튜브에 배치된 40nm 필터를 사용하여 세포를 필터링합니다.</li>
		<li>형광 활성화 셀 선별기에서 세포를 분석합니다. 패널을 다음과 같이 설정합니다. 첫째, DAPI-세포를 게이팅하여 총 세포 수에서 죽은 세포를 제거한 다음 CD29+CD90+CD45를 대상으로 한 mBMSC로서 선택된 세포에서 제거합니다.</li>
		<li>정렬된 CD29+CD90+CD45- 셀을 3mL의 α-MEM(10% FBS)이 미리 준비된 15mL 원심분리기 튜브로 수집합니다.</li>
		<li>5 분 동안 800 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 컬렉션 버퍼를 제거하고 10%의 FBS가 있는 신선한 α-MEM 1mL을 추가하여 셀을 다시 일시 중지합니다. 그런 다음 6cm 문화 요리에 접시를 접시에 담아 놓습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 식민지 형성 능력
참고: 이 단계는 mBMSC의 분할 능력을 확인하기 위해 수행되었습니다. 15
<ol><li>이 실험에 대해 두 번째 통로 mBMSC(P2)를 선택합니다. 세포 합류가 80%에서 90%에 도달하면, 6웰 플레이트의 직렬 그라데이션에서 세포를 재시드하여 클로날 증식 능력을 평가합니다. 참고: 그라데이션을 1 x 102에서 1 x 103 세포로 설정하는 것이 좋지만 인간 또는 동물 기원의 상이한 세포주의 최종 희석은 경험적으로 결정되었습니다.</li>
	<li>α-MEM에서 세포를 배양 (와 10% FBS) 식민지 형성 단위의 좋은 수가 빛 현미경에서 볼 수 있을 때까지 약 2 주 동안. 3일마다 배양 매체를 새로 고칩니다.</li>
	<li>배양 배지를 흡기하고 폐기하고, PBS로 우물을 한 번에 5분 동안 두 번 씻는다. 다음으로 각 웰에 4 % 파라포름 알데히드 솔루션을 추가하고 적어도 10 분 동안 수정합니다.</li>
	<li>파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 우물을 두 번 헹구는 다.</li>
	<li>크리스탈 바이올렛 염색 용액으로 세포를 염색하고 약 10 분 동안 37 °C로 배양하십시오. 참고: 원하는 음영이 이루어질 때까지 염색 시간이 적절하게 조정되었습니다.</li>
	<li>염색 용액을 제거하고 샘플을 증류수로 씻어 반응을 중지합니다.</li>
	<li>입체 현미경의 밑에 심상 및 적어도 50개의 세포로 구성된 흩어진 세포 식민지를 계산합니다.</li>
</ol>4. mBMSC의 다중 리니지 차별화
참고: P2 mBMSC는 달리 설명되지 않는 한 후속 실험에 사용되었습니다.
<ol><li>mBMSC의 골성 유도<ol>
<li>위에서 설명한 대로 mBMSC를 소화합니다. 종자 세포는 1mL α-MEM(10% FBS)으로 보충된 12개의 웰 플레이트에서 2.5 x 105/cm2의 밀도로.</li>
		<li>세포 합류가 60-70%에 도달하면 배지를 30%의 골성 유도 매체로 변경합니다. α-MEM(10%의 FBS)을 가진 세포를 음수 대조군으로 배양하고 2일마다 배지를 변경합니다. 참고: 골발생 시 칼슘 요절이 많이 나타난 후, 중간 교환 패턴을 2일마다 반부량의 중간 교환으로 변경하여 골세포가 떠다니는 것을 방지하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>7일 동안 배양한 후, 알칼리성 인산염염색(16,17)에의해 이들 세포의 석회화를 평가한다.</li>
		<li>배양 배지를 제거하고 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오. 잘 1mL의 PBS를 사용하여 세포를 헹구고 3 분 동안 두 번.</li>
		<li>그런 다음 알칼리성 인산염 염색 용액으로 세포를 염색하고 10-30 분 동안 37 °C에서 배양합니다. 참고: 필요한 색상을 얻기 위해 실온에서 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.</li>
		<li>우물을 증류수로 씻어 반응을 멈춥시다. 가벼운 현미경으로 사진을 찍습니다. 적색 색소 과립은 알칼리성 인산염 (ALP) 활성을 나타냅니다.</li>
		<li>나머지 세포를 7일 동안 배양한 후, 알리자린 적색 염색을 수행하여 세포의 광물화 능력을 평가한다.</li>
		<li>세포 고정 후 0.5% 알리자린 적색 염색 용액으로 세포를 10분16,18에염색한다. 3-5 분 후에 증류수로 염색체 반응을 중단하십시오. 참고: 개발된 색상에 따라 반응 시간을 연장할 수 있습니다.</li>
		<li>마지막으로, 배양판을 빛 현미경 아래에 놓아 골성 염색효과를 관찰한다. 붉은 목절은 이 세포의 칼슘 퇴적물을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC의 유도<ol>
<li>상기와 같이 12웰 플레이트에서 종자 P2 mBMSC.</li>
		<li>웰이 90% 컨서크후, 반포성 분화 배지A를 가진 세포를 배양하여 α-MEM 배양 배지(10% FBS)에서 배양된 세포를 음수 대조군으로 사용한다.</li>
		<li>유도 2일 후, 배지 A를 우물에서 흡인시키고 각 웰에 1mL의 비원성 분화 매체 B를 첨가한다.</li>
		<li>하루 후, 중간 크기 B를 제거하고 우물에 다시 추가 된 중간 A와 함께 다시 주기를 시작합니다. 중간 크기 A 및 B를 사용하여 세포를 번갈아 배양합니다.</li>
		<li>분화 배지 A와 B를 3주기동안 번갈아 적용하고 오일 레드 O 염색16,18에의해 이들 세포의 분리 발생을 검출한다. 참고: 둥근 및 큰 지질 방울의 제비는 추가 2 3 일 동안 분화 매체 B로 이 세포를 배양하여 관찰될 수 있습니다.</li>
		<li>배지를 제거하고 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. PBS로 셀을 씻어내라.</li>
		<li>오일 레드 O 염색 용액으로 세포를 염색하고 약 3 분 동안 37 °C에서 배양합니다.</li>
		<li>염색 용액을 제거하고 증류수로 우물을 씻으시다.</li>
		<li>빛 현미경으로 사이포발생을 관찰한다.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC의 연골 발생 유도<ol>
<li>종자 P2 mBMSC 15 mL 원심분리기 튜브에서 5 x 105/cm2의밀도.</li>
		<li>300 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>연골분화 배지의 0.5 mL로 세포를 다시 중단한다. 세포를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>원심분리기 튜브의 캡을 풀고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 매 2일마다 매체를 갱신합니다. 참고: 세포는 24시간 후에 펠릿을 시작합니다. 원심분리기 튜브를 48h로 옮기지 않는 것이 좋습니다. 매체를 변경할 때 세포 펠릿을 흡인하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>유도 21 일 후, 탈수, 파라핀 포함 및 단면다음 4 % 파라 포름 알데히드로 세포 펠릿을 수정합니다.</li>
		<li>탈파화 및 수분 공급 후, 알시안 블루 용액의 슬라이드를 최소 15분18,19,20,21에염색한 다음 증류수로 씻어 반응을 중지합니다. 가벼운 현미경으로 사진을 캡처합니다.</li>
		<li>콜라겐 타입 II의 면역 형광 염색의 경우, 아래 단계를 수행하십시오.<ol>
<li>5 μg/mL 단백질Ase K로 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 배양하여 데파라피화 및 수분 화 단계 후 배양합니다.</li>
			<li>슬라이드를 블로킹 버퍼에서 37°C에서 1h로 배양합니다.</li>
			<li>콜라겐 형 II 항체의 1 μL을 슬라이드에 블로킹 버퍼의 200 μL에 적용하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
			<li>다음 날, PBS로 슬라이드를 두 번 세척하고 1 시간 동안 37 °C에서 이차 항체로 배양하십시오.</li>
			<li>슬라이스를 40,6-디아미티노-2-페닐린돌(DAPI)으로 10분 간 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>형광 현미경 검사의 밑에 각 슬라이드의 사진을 찍습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 실시간 PCR
<ol><li>구아니듐 이소티오카네이트 기반의 시판제를 사용하여 mBMSC로부터 총 RNA를 추출한다.</li>
	<li>상용 키트를 사용하여 상호 보완적인 DNA로 RNA의 역 전사를 수행합니다. 역전사의 반응 조건은 다음과 같이: 5분 동안 65°C, 15분 동안 37°C, 15s에 대한 85°C.</li>
	<li>표 3에 나열된 프라이머를 사용하여 골발생 및 사이포발생 특이적 유전자를 검출하기 위해 실시간 PCR을 수행한다. PCR 증폭 절차는 다음과 같이: 5 분 동안 95 °C. 5 초에 대한 95 °C, 40 사이클에 대한 30 초에 대한 60 °C.</li>
</ol>

<ol>
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M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro.">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li><li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Icariin+prevents+oestrogen+deficiency-induced+alveolar+bone+loss+through+promoting+osteogenesis+via+STAT3.">Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3.</a> Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).</li><li>Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+response+of+mesenchymal+stem+cells+to+continuous+mechanical+strain+is+dependent+on+ERK1/2-Runx2+signaling.">Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling.</a> Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).</li><li>Lach, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Pluripotent+Stem+Cells+under+Controllable+Serum-Free+Conditions.">Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).</li><li>Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+the+WNT-Signaling+Modulators+BIO+and+PKF118-310+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).</li><li>Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+Chondrogenic+Differentiation+Potential+of+Equine+Synovial+Membrane-Derived+and+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.">Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).</li><li>Li, X., Zhang, Y., Qi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+isolation+methods+and+culture+conditions+for+rat+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).</li><li>Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+(bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells)+for+bone+tissue+engineering:+basic+science+to+clinical+translation.">Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+protocol+for+long-term+culture+of+murine+bone+marrow+stromal(mesenchymal)+stem+cells+that+retained+their+in+vitro+and+in+vivo+stemness+in+long-term+culture.">A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture.</a> Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).</li></ol>

모든 저자는 이해 상충이 없다고 말합니다.

이 프로토콜은 전체 골수 준수 및 형광 세포 분류를 결합하여 체외에서 쥐 하악에서 BMSC를 분리하는 방법을 설명하며, 이는 강력한 분화 능력으로 증식 mBMSC를 얻을 수있는 간단하고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 방법은 유동 셀 정렬에 의해 mBMSC를 예열적으로 정화할 수 있지만 세포 균질성에 대한 요구 사항이 더 높은 경우 보다 정확한 정제 방법이 필요할 수 있습니다.
현재...

골수 관두 줄기 세포(BMSC)는 골수로부터 유래된 비-조혈 줄기 세포로, 강력한 증식 능력과 다중 계측 분화 전위1,2,3,4를나타낸다. 실제로, BMSCs는 뼈 조직 공학 및 재생을 위한 이상적인 후보로 그(것)들이 발견된 이래로 여겨졌습니다. 수년 동안, 경골과 대퇴골과 같은 장골 문장 또는 긴 뼈는 두개안 면재생을 위한 BMSCs의 일반적인 근원이었습니다. 그러나, 하악 BMSC(mBMSC)와 같은 오로페이셜 BMSC는 상이한 배아 기원 및 발달 패턴과 같은 긴 뼈 BMSC로부터 약간의 차이를 표시합니다. 하악은 신경 절제술 세균 층의 신경 문장 세포에서 발생하고 관상 골화를 겪는 반면, 축 및 부속 골격은 중년에서 온 것이며 내뇌부 진동을 겪습니다. 더욱이, 임상 관찰 및 실험동물 연구는 지속적으로 오로페이셜과 일악 문장 BMSC5,6,7,8사이에 기능적 차이가 있음을 나타내고있다. 보고서에 따르면 BMSC는 하악, 상악뼈 및 폐포 뼈와 같은 두개골 면성 뼈에서 유래한 것으로 나타났으며, 축 및 부속뼈9보다우수한 증식, 수명 및 분화 능력을 나타냈다. 따라서 mBMSC는 케루비즘, 턱 종양, 턱 뼈의 골다공증 및 치주 조직 결함10,11,12와같은 두개골 면질환의 미래 치료적용을위한 바람직한 자원으로 간주됩니다. 전임상 실험에서 치료 잠재력을 이해하려면 시험관내에서 mBMSC를 빠르게 격리하고 배양하는 방법을 확립하는 것이 필수적입니다.
이 연구에서는, 목표는 전체 골수 준수 및 흐름 세포 측정 분류에 의해 정제 된 mBMSC를 얻는 것이었습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro-CT) 및 조직학적 섹션을 통해 명확하게 관찰 된 쥐 하악의 해부학 적 형태는 하악의 궤적 뼈가 절개 수막 공간과 폐포 뼈 사이에 있음을 보여 주었다. 궤적 골수로부터의 골수는 하악골 세포를 얻기 위해 플러시되었지만, 이런 식으로 배양된 세포는 순수한 mBMSC가 아니었으며 뼈, 지방 및 내피 세포로부터의 세포와 같은 다양한 혈통을 가진 여러 유형의 세포로 구성될 가능성이 있었다13,14. 세포 정화의 다음 단계는 특히 중요했다. 유동 세포질은 세포 표면 단백질의 조합을 인식함으로써 세포를 필터링하고 중간엽 줄기 세포의 농축에 널리 채택되어 왔다. 세포 균질성은 유동 세포측정의 주요 장점이지만, 공정은 세포 생존가능성을 결정하지 못하고 제한된 세포 수율을 초래할 수 있다. 이 연구에서는, 전체 골수 준수에서 얻은 P0 mBMSC는 높은 순도와 강한 증식 능력을 가진 mBMSC를 얻기 위하여 유동 세포질에 의해 분류되었습니다.
이 연구는 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별의 조합을 사용하여 쥐 하악 BMSC의 격리, 문화 및 분화를 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 소개합니다. 관련 분야의 연구원이 사용할 수 있는 안정적이고 편리한 방법입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acutenaculum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adipogenic differentiation medium</td>
			<td>Cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase Color Development Kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C3206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-Minimum essential medium</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30265.01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti -CollagenII Rabbit pAb</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies against CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td>biolegend inc</td>
			<td>102215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Esco</td>
			<td>AC2-4S8-CN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-0461-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0900-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>L500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondrogenesis differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet Staining Solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Esco</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magzol reagent(Trizol reagent)</td>
			<td>Magen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osteogenic differentiation medium</td>
			<td>cyagen biosciences inc.</td>
			<td>MUBMX-90021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#65288;1X&#65289;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Kit</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td>RR036A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickBlock Blocking Buffer</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>P0260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR1 Premix</td>
			<td>TakaRa Bio Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats

여기서 우리는 실험 요구 사항에 대한 수많은 고품질 세포를 빠르게 얻기 위해 시험관에서 하골 골수 중년 줄기 세포 (mBMSC)를 격리하고 배양하는 효율적인 방법을 제시합니다. mBMSC는 우수한 자기 갱신 능력과 다중 계보 분화 잠재력으로 인해 미래에 두개골 면질환 및 두개골 -상악안면 재생의 경우 조직 공학 세포로서 치료 응용 분야에서 널리 사용될 수 있습니다. 따라서 대량으로 mBMSC를 얻는 것이 중요합니다.
이 연구에서는, 골수는 하악에서 플러시되었고 1 차적인 mBMSCs는 전체 골수 부착 재배를 통해 격리되었다. 또한, CD29+CD90+CD45- mBMSC는 형광 세포 분류를 통해 정제되었다. 정제 된 mBMSC의 2 세대는 추가 연구를 위해 사용되었고 골세포, 지방 세포 및 연골 세포로 분화할 수있는 잠재력을 표시했습니다. 이를 활용한 시험관 내 모델을 활용하여 생물학적 특성, 마이크로 환경에 대한 후속 반응 및 mBMSC의 다른 응용 분야의 연구를 용이하게 할 수 있는 많은 수의 증식 mBMSC를 얻을 수 있다.

이 프로토콜을 사용하여, 세포의 큰 비율은 초기 배양 후 3 일에 플레이트에 부착. 전형적으로, 추가 3-4일 배양 후, 세포 합류는 70~80%(도1B)에도달하였다. 형광 세포 분류, DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSC는 P0 세포에서 약 81.1 %를 차지하는18,22를정제하였다(도 1C).
P2 mBM...

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Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

이 문서에서는 쥐 하악에서 골수 메선 줄기 세포를 분리, 재배, 선별 및 식별하기 위한 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별을 결합하는 방법을 제시합니다.

쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

isolation-cultivation-mandibular-bone-marrow-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K 조회수.  National Clinical Research center of Stomatology. 이 문서에서는 쥐 하악에서 골수 메선 줄기 세포를 분리, 재배, 선별 및 식별하기 위한 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별을 결합하는 방법을 제시합니다.

비디오: Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

연구

의학

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, synovial-fluid-derived MSCs were reported to have multi-lineage differentiation potential and immunomodulatory features, which indicates that these cells can be used for tissue engineering and systemic treatments. This study presents a protocol for simple and non-invasive isolation of MSCs derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs to analyze cell surface markers for cell phenotyping and in vitro culturing. Using sexually mature six-month-old minipigs, bone marrow was extracted from the iliac crest bone using a bone marrow extractor, and the synovial fluid was aspirated from the femorotibial joint. Procedures for the collection of samples from both sources were non-invasive. The protocols for effective isolation of MSCs from harvested cell sources and for creating in vitro culture conditions to expand stable MSCs from minipigs and the application of systemic autologous treatments are provided. For cell phenotyping, the cell surface markers of both cells were analyzed using flow cytometry. In the results, the MSCs were isolated from the synovial fluid of the minipigs and showed that synovial-fluid-derived MSCs have a similar morphology and cell phenotype to bone-marrow-derived MSCs. Therefore, non-invasively obtained synovial fluid is a valuable source of MSCs.

A protocol establishing mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from the synovial fluid and bone marrow of minipigs and non-invasively collected using syringe aspiration is presented. Cellular phenotyping was performed using flow cytometry after cell isolation and in vitro cultivation of bone marrow and synovial fluids derived from MSCs.

Minipigs의 활액과 골수 유래 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 세포 표현형

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result from altered activity of cells responsible for enamel synthesis named ameloblasts, which present in enamel organ. During amelogenesis, ameloblasts follow a specific and precise sequence of events of proliferation, differentiation, and death. A rat continually growing incisors is a suitable experimental model to study ameloblast activity and differentiation stages in physiological and pathological conditions. Here, we describe a reliable and consistent method to micro-dissect enamel organ of rats exposed to environmental toxicants. The micro-dissected dental epithelia contain secretion- and maturation-stage ameloblasts that may be used for qualitative experiments, such as immunohistochemistry assays and in situ hybridization, as well as for quantitative analyses such as RT-qPCR, RNA-seq, and Western blotting.

Understanding enamel formation and possible alterations requires the study of ameloblast activity. Here, we describe a reliable and consistent method to micro-dissect enamel organs containing secretion- and maturation-stage ameloblasts that may be used for further quantitative and qualitative experimental procedures.

사기 질 기관 이용과 환경에 노출 된 쥐의 악의 니에서의 마이크로 해 부

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

An Enzyme-free Method for Isolation and Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. As a clinically relevant cell type, optimal methods are needed to isolate and expand these cells in vitro. Most methods to isolate adipose-derived MSCs (ADSCs) rely on harsh enzymes, such as collagenase, to digest the adipose tissue. However, while effective at breaking down the adipose tissue and yielding a high ADSC recovery, these enzymes are expensive and can have detrimental effect on the ADSCs &#8212; including the risks of using xenogeneic components in clinical applications. This protocol details a method to isolate ADSCs from fresh lipoaspirate and abdominoplasty samples without enzymes. Briefly, this method relies on mechanical disassociation of any bulk tissue followed by an explant-type culture system. The ADSCs are permitted to migrate out of tissue and onto the tissue culture plate, after which the ADSCs can be cultured and expanded in vitro for any number of research and/or clinical applications.

This protocol provides an enzyme-free method for isolating mesenchymal stem cells from abdominoplasty and lipoaspirate samples using an explant method. The absence of harsh enzymes or centrifugation steps provides for clinically relevant stem cells that can be used for studies in vitro or transferred back to the clinic.

인간 지방분지 유래 중간엽 줄기 세포의 분리 및 확장을 위한 효소 없는 방법

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a population of multipotent cells that can be isolated from various adult and fetal tissues, including adipose tissue. ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.