이 프로토콜은 연구원이 분자 및 화학적 동요와 정량적 행동 분석을 결합하여 이 행동의 근본적인 planarian 행동 및 sec 메커니즘을 명확히 할 수 있게 합니다. 이 기술은 무료 이동 평면주의의 정량적 행동 판독을 얻기 위해 고급 악기 또는 전문 소프트웨어가 필요하지 않기 때문에 모든 기술 수준에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 스크런치는 플래니언의 예외를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 제노바이오틱스와 질병으로 인한 신경계 기능을 방해하는 분석에 민감한 종점 역할을 합니다.
먼저 균일한 흰색 배경을 제공하고 적절한 콘트라스트를 얻기 위해 조정 가능한 광원으로 사용할 수 있는 평평한 표면에 딤미가능 LED 패널을 배치하여 시작합니다. LED 패널에 100mm 페트리 접시 경기장을 놓습니다. 경기장 위의 링 스탠드에 카메라를 장착하고 필요에 따라 위치, 높이 및 초점을 조정하여 전체 경기장이 시야 에 중심을 두고 초점을 맞춥니다.
적절한 노출 매체의 약 25밀리리터로 경기장을 채우고, LED 패널을 켜고, 기록 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있는 다른 광원을 끕니다. 전사 파이펫을 사용하여 경기장 중앙에 평면을 떨어 뜨립니다. 화학 용액을 테스트 할 때, 화학 물질의 농도가 크게 변경되지 않도록 가능한 한 평면 수의 작은 평면을 전송합니다.
네이티브 피지 형식으로 이미지 시퀀스로 데이터를 기록하기 시작합니다. 글라이딩 실험의 경우, 스크런치 또는 연동 실험을 위해 1~2분 동안 미끄러지기 동작을 기록하여 직선으로 발생하는 최소 3회 연속 진동을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 길게 기록합니다. 실험이 완료되면 레코딩을 종료합니다.
플래니언이 종료 기준을 충족하지 않고 경기장 경계에 도달하면, 플래니언을 경기장 중앙으로 되돌려 보라고 한다. 피지에서 실험에 대 한 원시 이미지 시퀀스를 열고 8 비트로 변환 하 고 이미지 시퀀스를 통해 팬 이미지 스택의 하단에 화살표 도구 또는 슬라이더를 사용 하 여. 기간 및 관심 영역을 추출하려면 직사각형 도구를 사용하여 평면주의의 전체 경로를 포괄하는 관심 영역을 그립니다.
이미지 스택을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 중복을 선택하고 중복 스택이 있는 상자를 선택합니다. 관심 시퀀스의 첫 번째 및 마지막 프레임을 입력하고 확인을 클릭합니다. 글라이딩 실험을 위해, 평면이 스크런치 또는 연무 실험을 위해 신체 길이의 적어도 두 배 이상 이동하는 글라이딩 기간을 추출하십시오.
평면이 최소 3회 연속및 완전한 신체 진동을 직선으로 거치면 인스턴스를 추출합니다. 중복된 이미지 스택에 임계값을 적용하여 이미지를 비나이즈화하고 백그라운드에서 평면을 추출하고 슬라이딩 바를 조정하여 전체 평면주의가 빨간색으로 강조 표시되도록 합니다. 정확한 값은 이미징 품질에 따라 다릅니다.
어두운 배경에 대 한 상자를 두고 히스토그램을 스택 하 고 범위를 선택 취소 하지 마십시오. 이미지 스택을 스크롤하여 임계값 범위가 좋은지 확인한 다음 적용을 클릭합니다. 변환 스택에서 이진 창으로 메서드를 기본값으로 설정하고 배경을 라이트로 설정합니다.
이 창의 모든 확인란을 선택 취소한 다음 확인을 클릭합니다. 흰색 배경에 검은 색 평면을 보여주는 바이나드 이미지가 나타납니다. 전체 평면주의가 이미지 시퀀스의 모든 프레임에 표시되는지 확인합니다.
분석 및 설정 측정을 클릭하여 측정을 설정합니다. 영역, 질량 중심, 스택 위치 및 타원에 맞게 상자를 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 열린 이미지 스택을 선택하고 분석하고 입자를 분석합니다.
분석 파티클 창에서 표시 및 마스크를 선택하여 선택한 매개 변수로 감지된 모든 개체를 보여주는 새 스택을 엽니다. 평면의 대략적인 영역을 입력하여 원치 않는 소음을 제거하기 위해 크기 필터를 설정합니다. 그런 다음 표시 결과에 대한 상자를 확인하고 결과를 취소하고 확인을 클릭합니다.
패널 하단의 슬라이더를 사용하여 마스크 이미지 스택을 통과하여 플래너리가 없는 소음이나 프레임이 없는지 확인합니다. 결과 창에서 파일을 사용하여 데이터를 저장하고 저장하고, CSV 확장을 파일 이름에 추가하여 쉼표 분리값으로 데이터를 저장합니다. 이미지 스택에 대한 데이터가 저장되면 각 이미지 스택 결과및 마스크 창을 닫습니다.
유해 한 온도를 통해 scrunching을 유도 하려면, 뜨거운 접시에 65 섭씨에 유리 비커에 위평면 물을 가열. 경기장 중앙에 평면을 놓고 똑바로 세우고 글라이딩을 시작할 때까지 기다린 다음 녹음을 시작합니다. P 200 파이펫을 사용하여 예열된 평면 수의 100 마이크로리터를 천천히 일관되게 피펫하고, 물두를 플래나리안의 꼬리 끝에 포스트하여 스크런치를 유도합니다.
녹화를 중지, 한 번 스크런치가 중단되었습니다. 플래너리안을 복구 용기에 넣고 페트리 접시에 더 많은 실험을 하면 신선한 실온 플라나리안 워터로 미디어를 교환합니다. 절단을 통해 스크런치를 유도하기 위해, 경기장의 중심으로 평면을 전송하고 평면 오리엔트 자체가 똑바로 똑바로 시작하고 글라이딩을 시작할 때까지 기다립니다.
그런 다음 녹음을 시작하고 깨끗한 면도날로 평면을 절단합니다. 실험 전반에 걸쳐 절단 위치가 일관되도록 합니다. 전방 조각이 스크런치를 중단하면 녹음을 중지합니다.
두 조각을 제거하고 별도의 용기에 넣고 7 일 동안 재생 할 수 있습니다. 절단 된 평면도는 재생되면 홈 컨테이너에 다시 통합 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 UV 광 노출 근처 여부를 테스트하는 데 사용되었다, S.mediterranea와 D.japonica planarians에서 스크런치를 유도, D.japonica planarians scrunch, UV 빛 근처에 노출 될 때, S.mediterranea planarians 꼬리 숱이 또는 응답을 전시.
적어도 3개의 연속 직선 스크런치를 전시한 D.japonica planarians에 대한 스크런치 매개변수의 정량화는 이 종에 대한 특성 스런치 매개변수를 드러내며, 이 종에 대한 특성을 드러내는 250 마이크로몰라 계피알데히드 알 수 없는 TRPA 의 한 가지 작용제는 생쥐에서 분쇄및 S.mediterranea를 유발합니다. D.japonica 플래너리안은 미끄러지거나 격렬한 머리 회전으로 중단된 뱀과 진동 운동의 혼합물을 표시합니다. 적어도 3회 연속 진동을 가진 시료의 정량화는, 4개의 파라미터 중 3개에 대해 현저히 낮은 값을 산출한 다음 D.japonica에서 스크런치에 대해 예상되는 것으로 관찰된 진동 운동이 크런치되지 않음을 나타냅니다.
RNAi는 S.지중해에서 계피 알데히드 노출에 대한 스크런치 및 반응의 특이성을 확인합니다. 플라나리안 물에 노출된 지 180초 만에 모든 제어 RNAi 플래나리안이 난항을 겪었다. SMTRPA 의 하나에 비해 한 RNAi 플래니안은 계피 알데히드에서 S.mediterranea 스크런치는 SMTRPA 하나를 필요로한다는 것을 보여주는.
일관되고 소음을 줄이고 행동 측정에서 재현성을 보장하기 위해 동물을 조작하는 방법은 일관성을 유지해야 합니다. 이 프로젝트는 여기에 캡처되지 않은 다른 평면 행동의 식별 및 정량화를 허용하는 신체 모양 분석을 포함하도록 확장 될 수 있습니다.
