이 작품은 만페이 스즈키 당뇨병 재단 (YT), 보스턴 아동 병원 OFD / BTREC / CTREC 교수 진로 개발 보조금, 보스턴 아동 병원 안과 재단, BCH 파일럿 상, BCH 맨튼 센터 펠로우십의 보조금에 의해 지원되었다, 리틀 기린 재단 (ZF), 독일 연구 재단 (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD)

설명된 모든 동물 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (ARCH 프로토콜 번호 19-04-3913R).
1. 준비
<ol><li>페니실린/스트렙토마이신(10000 U/mL)과 5mL 및 10mL의 상용 보충제를 500mL의 완전한 클래식 매체에 추가합니다. Aliquot 50 mL 의 배지 는 처음에. 참고: 오염을 방지하기 위해 배지를 재고로 되돌리지 마십시오.</li>
	<li>얼음에 완전한 클래식 매체의 알리쿼트를 넣습니다.</li>
	<li>70%의 에탄올을 사용하여 해부하는 현미경, 집게 및 가위를 청소하십시오.</li>
	<li>2개의 세포 배양 접시 (10cm), 해부 현미경에 하나, 얼음에 하나 준비; 각 접시에 완전한 클래식 매체 10 mL을 넣습니다.</li>
</ol>2. 실험 단계(그림 1)
<ol><li>산후 (P) 주위에 C57BL/6J 마우스를 희생 (P) 20 75-100 mg/kg 케타민과 7.5-10 mg/kg 자일라진 주입을 사용 하 여. 해부 전에 얼음에 완전한 고전적인 매체에 눈을 유지합니다.</li>
	<li>눈에 결합 조직 (근육과 지방 조직) 및 시신경을 제거합니다.</li>
	<li>마이크로 가위를 사용하여 0.5mm 후방을 각막 limbus로 원주 절단합니다. 각막/홍채 복합체, 유리체 및 렌즈를 제거합니다.</li>
	<li>시신경을 향해 절단 가장자리에 수직으로 1mm 절개를 하고 1mm 너비의 할례 밴드를 자릅니다. 복합체의 중앙 및 주변 영역을 분리합니다. 집게를 사용하여 RPE/choroid/sclera 복합체에서 망막을 벗깁니다.</li>
	<li>주변 초보 밴드를 얼음에 완벽한 클래식 매체로 유지하십시오. 다른 눈을 분리하고 두 번째 밴드를 잘라 과정을 반복합니다.</li>
	<li>원형 밴드를 6 ~동등한 사각형 조각 (~1mm x 1mm)으로 자른다. 참고: 가장자리를 만지지 마십시오.</li>
	<li>제조의 지시에 따라 기저막 추출물(BME)을 해동합니다. 24 개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물의 중심에 30 μL / 웰BME를 추가합니다. BME의 액적가장자리가 가장자리를 건드리지 않고 플레이트 바닥에 볼록돔을 형성해야 합니다. 참고 : 냉장고에서 하룻밤 BME를 해동하십시오. BME는 해동 후 언제든지 얼음위에 있어야 합니다.</li>
	<li>BME의 중간에 조직을 배치합니다. 참고 : 코로이드 축출을 평평하게하지 마십시오; 일반적으로, 조직이 BME 내에서 확장하자. 조직의 방향 (경피측 위 또는 아래) 실험 결과에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>37°C에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 젤이 고화하게 합니다.</li>
	<li>전체 클래식 중간/웰의 500 μL을 추가합니다.</li>
	<li>격일(500 μL)의 클래식 매체를 변경합니다. 코로이드 발아는 현미경으로 3 일 후에 관찰 될 수있다. 참고: 성장 인자 치료를 위해 4 시간 동안 조직을 굶어. 성장 인자 감소 매체에서 시험 화합물을 희석 (1:200 대신 부스트 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT-코로이드 전산화 정량화 방법17 (도 2)
참고: 성장하는 선박이 적용되는 영역을 측정하는 전산화 된 방법이 사용되었습니다. ImageJ 소프트웨어에 대한 매크로 플러그인은 정량화 하기 전에 필요합니다(자세한 내용은 추가 정보 참조).
<ol><li>ImageJ로 코로이드 발아 이미지를 열고"이미지 | 유형| 회색눈금으로 8비트"</li>
	<li>"이미지| 조정 | 밝기/콘트라스트(Ctrl/shift/C)" 및 콘트라스트를 최적화합니다.</li>
	<li>마법 지팡이 기능을 사용하여 새싹 중앙에 존재하는 코로이드 조직을 이미지에서 윤곽을 그리고 제거합니다(바로 가기 키"F1")(그림2A, B). 참고: 마법 지팡이의 허용 오차 속도를 20-30%로 설정합니다.</li>
	<li>무료 선택도구(그림 2C)로이미지의 배경을 제거합니다. "이미지| 조정 | 임계값(Ctrl/shift/T)". 임계값 함수를 사용하여 배경 및 주변부(그림2D)에대해 미세 혈관 새싹을 정의합니다.</li>
	<li>"F2"를클릭하면 요약이 나타납니다. "저장"을 클릭하여 선택한 영역의 이미지를저장합니다. 향후 참조를 위해 원본 이미지와 동일한 폴더에 저장합니다.</li>
	<li>샘플 그룹을 측정한 후 데이터 분석을 위해 기록된 샘플을 복사합니다. 참고:"분석| 스케일 바가 있는 이미지를 사용하여 "배율"을 설정합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration.">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li><li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration.">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li><li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders.">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders.">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).</li><li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+macular+edema:+Beyond+the+surface.">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models.">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).</li><li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC:+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5.">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li><li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels.">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice.">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization.">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li><li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model.">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li><li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+ring+assay.">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).</li><li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Aortic+Ring+Assay:+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis.">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li><li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells:+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay.">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939 (2020).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+(EMRA)+assay.">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li><li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choroid+sprouting+assay:+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis.">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).</li><li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice.">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis.">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization.">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li><li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7/miR-126+locus.">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470 (2019).</li><li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats.">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents.">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li><li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine+proliferated+CD34(+)+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture.">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overproduction+of+N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat.">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li><li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance.">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li><li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li></ol>

저자는 재정 적 공개가 없습니다. 전산화 된 방법은 저자를 통해 교육 기관에 무료로 사용할 수 있습니다.

천로이드 발아 분석체는 NEovascular AMD9,10,18,19,20에서연구를 돕습니다. 초로이드 이질은 쥐뿐만 아니라 쥐와인간(17,21)으로부터분리될 수 있다. choroid 축출에는 EC, 대식세포 및 pericytes17이포함됩니다. 이 분석에서 ch...

Choroidal 혈관 신생 이소화 조절은 신생 혈관 노화 관련 황반 변성 (AMD)1과관련이 있습니다. choroid는 망막 색소 상피 (RPE) 아래에 존재하는 미세 혈관 침대입니다. 코로이드의 혈류감소는 AMD2의진행과 관련이 있는 것으로 나타났다. 혈관 내피, RPE, 대식세포, 회낭체 및 기타 세포 사이의 복잡한 관계는 조직3,4,5의항상성에 대한 책임이 있다. 따라서, 재현 가능한 분석 모델링 choroidal 마이크로 환경은 neovascular AMD의 연구에 대 한 중요 한.
전 생체 혈관 신생 분석 및 체외 내피 세포 배양은 생체 내 미생물 의 행동, 신약 테스트 및 병인의 연구를 보완 할 수 있습니다. 인간 망막 미생물 내피 세포(HRMEC), 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC), 격리된 원발성 동물 뇌 또는 망막 IC와 같은 내피 세포는 종종 안구 혈관 신생 연구6,7,8을위한 체외 연구에서 사용된다. 특히 HRMEC는 내피증, 이주, 관 형성 및 혈관 누설을 평가하여 체외 외 혈관 신생혈관화(CNV)9의 모델로 널리 사용되어 내정간섭6,10을평가한다. 그러나, 배양에 있는 EC는 choroid에서 찾아낸 그밖 세포 모형과의 상호 작용의 부족 때문에 CNV의 모형으로 제한되고 이 소집에서 이용되는 대부분의 EC는 choroid에서 유래하지 않기 때문에. 마우스 코로이드 EC는 문화권에서 분리하고 유지하기가 어렵습니다.
대동맥 고리 분석은 매크로 혈관 증식의 모델로 널리 사용된다. 대동맥 각출소에서 혈관 새싹은 EC, 백혈구 및대식세포(11)를포함한다. 대동맥 고리 분석모델은 큰 혈관 혈관신생을 잘12,13,14로모델한다. 그러나, 대동맥 고리로서 코로이드 외혈관화의 모델로서 한계가 있어 특징적인 초로이드 미생물 혈관 환경이 결여된 대색조직이며, 큰 혈관으로부터의 새싹은 미생물 병리학에 관여하는 모세관 네트워크로부터 새싹과 다를 수 있다. 최근 그룹은 전 생체 망막 분석15,16을발표했다. 망막 신혈관 질환에 적합하지만 AMD에서 볼 수 있듯이 코로이드 신혈관화에는 적합하지 않습니다.
마우스 RPE, 코로이드 및 경마 성 이식 조직을 이용한 코로이드 발아 분석체는 CNV를 더 잘 모델링하기 위해 개발되었다. 조직은 마우스 (또는 다른 종) 눈(17)로부터쉽게 분리 될 수 있습니다. 이 분석법은 약리학적 화합물의 프로 및 항 혈관 신생 잠재력의 재현 가능한 평가 및 유전자 변형 마우스로부터 조직을 사용하여 코로이드 신생 혈관화에서 특정 경로의 역할의 평가 및 제어18을허용한다. 이 코로이드 발아 분석체는 많은 후속 간행물9,10,18,19,20에서참조되었다. 여기서, 이 분석법의 사용에 관여하는 방법이 입증된다.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Basal membrane extract (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr><tr><td>Complete classic medium with serum and CultureBoost</td><td>Cell systems</td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>use for 70%</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>Tissue culture plate (24-well)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (Ketamine)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

an ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis

노화와 관련된 황반 변성의 현저한 특징인 병리학적인 천동 혈관신생은 시력 장애와 실명으로 이어집니다. 인체망막 내피 세포(EC) 증식 분석(HRMEC) 또는 분리된 1차 망막 IC를 이용한 증식 분석은 생체외 모델에서 망막 혈관신생을 연구하는 데 널리 사용된다. 그러나, 순수한 뮤린망 내피 세포를 격리하는 것은 기술적으로 도전적이고 망막 EC는 choroidal 내피 세포 및 다른 세포/세포 상호 작용과 다른 증식 반응을 가질 수 있다. 초로이드 미생물 증식의 모델로서 매우 재현 가능한 전 생체 균 발아 분석이 개발되었다. 이 모형은 choroid 혈관분기 (EC, 대식세포, pericytes) 및 망막 안료 상피 (RPE)사이 상호 작용을 포함합니다. 마우스 RPE/choroid/scleral 이병은 성장 인자 감소 기막 추출물(BME)(일 0)에서 분리되고 배양됩니다. 배지는 격일로 변경되고 코로이드 발아는 6일째에 정량화된다. 개별 choroid explant의 이미지는 반전된 상 현미경으로 촬영되고 발아 영역은 이 실험실에서 개발된 ImageJ 소프트웨어에 반자동 매크로 플러그인을 사용하여 정량화됩니다. 이 재현 가능한 ex vivo choroidal 발아 분석은 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 choroidal 마이크로 혈관 증식에 관여하는 경로를 평가하기 위해 잠재적 인 치료 및 마이크로 혈관 질환 연구에 대한 화합물을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

하루에 빛나는 choroid 의 성장의 비교
우리는 BME에 내장 된 sclera로 choroid를 해부하고 6 일 동안 배양(그림 1). 3일부터 6일까지 C57BL/6J 마우스에서 의초로이드 발아는 현미경으로 검사되었고 IMAGEJ에서 반자동 정량화 방법인 SWIFT-Choroid로 정량화되었다. 대표적인 경우, 축출면적(축출자체를 제외한 각성으로부터 연장된 혈관)은 3일째 0.38mm2(그...

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An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

an-ex-vivo-choroid-sprouting-assay-ocular-microvascular

Research

JoVE Journal

Biology

5.5K 조회수.  Boston Children's Hospital, Harvard Medical School. 이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

비디오: An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

연구

의학

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

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Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

발생학

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

신경과학

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

생체공학

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular cells. Isolating, culturing, and sustaining retinal neurons in vitro have technical and biological limitations. Culturing retinal explants may overcome these limitations and offer a unique ex vivo model to study the cross-talk between various retinal cells with well-controlled biochemical parameters and independent of the vascular system. Moreover, retinal explants are an effective screening tool for studying novel pharmacological interventions in various retinal vascular and neurodegenerative diseases such as diabetic retinopathy. Here, we describe a detailed protocol for retinal explants' isolation and culture for an extended period. The manuscript also presents some of the technical problems during this procedure that may affect the desired outcomes and reproducibility of the retinal explant culture. The immunostaining of the retinal vessels, glial cells, and neurons demonstrated intact retinal capillaries and neuroglial cells after 2 weeks from the beginning of the retinal explant culture. This establishes retinal explants as a reliable tool for studying changes in the retinal vasculature and neuroglial cells under conditions that mimic retinal diseases such as diabetic retinopathy.

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

This protocol presents and describes steps for the isolation, dissection, culturing, and staining of retinal explants obtained from an adult mouse. This method is beneficial as an ex vivo model for studying different retinal neurovascular diseases such as diabetic retinopathy.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Scratch Wound Migration 및 Spheroid Srouting Assay를 이용한 혈관신생 연구

Investigating Angiogenesis on a Functional and Molecular Level by Leveraging the Scratch Wound Migration Assay and the Spheroid Sprouting Assay

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A detailed understanding of the underlying molecular mechanisms and reliable screening models are essential for targeting diseases effectively and developing new therapeutic options. Several in vitro assays have been developed to model angiogenesis, capitalizing on the opportunities a controlled environment provides to elucidate angiogenic drivers at a molecular level and screen for therapeutic targets.
This study presents workflows for investigating angiogenesis in vitro using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). We detail a scratch wound migration assay utilizing a live cell imaging system measuring endothelial cell migration in a 2D setting and the spheroid sprouting assay assessing endothelial cell sprouting in a 3D setting provided by a collagen matrix. Additionally, we outline strategies for sample preparation to enable further molecular analyses such as transcriptomics, particularly in the 3D setting, including RNA extraction as well as immunocytochemistry. Altogether, this framework offers scientists a reliable and versatile toolset to pursue their scientific inquiries in in vitro angiogenesis assays.

저자 스포트라이트: Investigating Angiogenesis Through Challenges and Innovations in Assay Development(분석 개발의 과제와 혁신을 통한 혈관신생 조사)

This study presents the two-dimensional (2D) scratch wound migration assay and the three-dimensional (3D) spheroid sprouting assay, along with their respective downstream analysis methods, including RNA extraction and immunocytochemistry, as suitable assays to study angiogenesis in vitro.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Angiogenesis plays a crucial role in both physiological and pathological processes within the body including tumor growth or neovascular eye disease. A ...

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for phenotypic drug discovery (PDD) programs. Although these novel devices could predict the safety and efficacy of investigational drugs in humans more accurately, their development to the clinic still strongly rely on mammalian data, notably the use of mouse disease models. In parallel to human organoid or organ-on-chip disease models, the development of relevant in vitro mouse models is therefore an unmet need for evaluating direct drug efficacy and safety comparisons between species and in vivo and in vitro conditions. Here, a vascular sprouting assay that utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies (EBs) is described. Vascularized EBs cultured onto 3D-collagen gel develop new blood vessels that expand, a process called sprouting angiogenesis. This model recapitulates key features of in vivo sprouting angiogenesis-formation of blood vessels from a pre-existing vascular network-including endothelial tip cell selection, endothelial cell migration and proliferation, cell guidance, tube formation, and mural cell recruitment. It is amenable to screening for drugs and genes modulating angiogenesis and shows similarities with recently described three-dimensional (3D) vascular assays based on human iPSC technologies.

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

This assay utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies cultured in 3D-collagen gel to analyze the biological processes that control sprouting angiogenesis in vitro. The technique can be applied for testing drugs, modeling diseases, and for studying specific genes in the context of deletions that are embryonically lethal.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

요약

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Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석