망막 연구의 과제 중 하나는 망막 뉴런, 신경교 세포 및 혈관 세포와 같은 서로 다른 세포 간의 혼선을 연구하는 것입니다. 특히, 망막 뉴런의 분리 및 배양은 어려운 일입니다. 우리는 배양된 망막 체외이식편이 이러한 한계를 극복하고 잘 통제된 생화학적 매개변수 하에서 혈관 시스템과 독립적으로 서로 다른 망막 세포 간의 혼선을 연구할 수 있는 독특한 생체 외 시스템을 제공할 수 있다고 믿습니다.
또한, 망막 체외이식편은 혈관 및 신경 손상을 특징으로 하는 당뇨병성 망막병증과 같은 다양한 망막혈관 및 신경퇴행성 질환에 대한 새로운 약리학적 개입을 연구하기 위한 탁월한 스크리닝 도구입니다. 우리 연구실은 수년간 미세 혈관 망막 기능 장애를 촉진하는 병태 생리 학적 변화를 연구 해 왔습니다. 생체 내 및 체외 모델을 포함한 다양한 모델을 활용하여 실험실 내에서 많은 기술을 최적화 할 수있었습니다.
여기에서는 2주 동안 배양 상태로 보관할 수 있는 야생형 성체 마우스에서 유래된 망막 체외이식편에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 동물을 일정한 온도와 빛이 통제되는 환경에서 보관하십시오. 모든 동물에게 건강, 적절한 음식 및 물을 검사하십시오.
동물에게 신선한 음식과 깨끗한 물을 제공하십시오. 더러워진 케이지를 매일 또는 동물의 건강을 위해 필요에 따라 교체하십시오. 12 주령 이상의 수컷 검은 색 6 마리를 사용하십시오.
이산화탄소 과다 복용 흡입으로 집 케이지에서 동물을 안락사시킵니다. 절차를 완료 한 후 심장 및 호흡 정지를 확인하거나 동물의 고정 및 확장 된 동공을 관찰하는 것과 같은 적절한 방법으로 동물의 죽음을 확인하십시오. 자궁 경부 탈구와 같은 안락사의 2 차 방법으로 사망 확인을 따르십시오.
지구가 튀어 나올 때까지 구부러진 집게를 사용하여 궤도에 압력을가하십시오. 눈의 뒤쪽 부분에서 집게를 부드럽게 닫고 연속적인 동작으로 들어 올립니다. 1 밀리리터의 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 1.5 밀리리터 튜브에 안구를 담그십시오.
안구를 완전한 배지가 들어있는 1.5 또는 2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 이제 해부 준비가되었습니다. 이 다이어그램은 망막 외식편을 만들기 위해 마우스 안구를 해부하기 위해 표시될 연속적인 단계를 보여줍니다.
안구를 열기 위해 윤부를 따라 원주 절개를합니다. 각막은 윤부 절개를 따라 해부를 통해 제거됩니다. 그런 다음 렌즈와 유리체를 제거하고 빈 아이 컵을 남깁니다.
미세한 집게로 시신경 머리 부위를 잡고 눈의 바깥 쪽 코트를 부드럽게 벗겨냅니다. 신경 망막을 손상시키지 않고 망막을 완전히 손상시키지 않기 위해 외부 코트를 제거하는 동안 큰주의를 기울입니다. 그런 다음 망막이 더 작은 조각으로 절단됩니다.
이것은 대조군과 실험 그룹이 같은 동물에서 파생 된 실험을 할 수 있기 때문에 큰 이점이 될 것입니다. 그러나 망막을 작은 조각으로 자르면 다루기가 더 어려워집니다. 따라서 우리는 망막 배양의 적절한 방향을 보장하기 위해 이러한 작은 망막 조각을 처리하는 기술을 개발했습니다.
망막 조각 바로 아래에 해부 가위 날을 열어 두십시오. 열린 가위 날의 끝으로 망막 조각을 천천히 들어 올리고 배양 접시로 부드럽게 옮깁니다. 체외이식편은 다중 웰 플레이트의 세포 배양 삽입물로 별도로 옮겨지며, 각 플레이트에는 신경 망막 쪽이 위를 향하도록 300마이크로리터의 망막 체외이식편 배지가 들어 있습니다.
망막 체외이식편 배양은 섭씨 37도 및 5%이산화탄소의 가습 인큐베이터에서 유지됩니다. 망막 표면이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. 망막 조각이 뒤집히거나 접힌 경우 올바른 방향으로 부드럽게 조정하십시오.
망막 외식편을 신경 망막이 위쪽을 향하도록 올바른 방향으로 배치하지 못하면 배양에서 망막 세포의 적절한 성장이 실패합니다. 여기서, 우리는 2주 동안 배양된 망막 체외이식편을 면역형광염색하는 것을 볼 수 있다. 체외이식편을 고정하고 망막 뉴런에 대한 NeuN, 신경교 세포에 대한 GFAP 및 혈관에 대한 렉틴으로 염색하였다.
염색은 잘 발달 된 망막 세포와 망막 혈관을 보여주었습니다. 여기에서 망막 체외이식편의 면역형광 염색이 고정되고 신경교세포에 GFAP로, 혈관에 렉틴으로 염색되는 것을 볼 수 있습니다. 이미지는 망막 세포와 망막 혈관 모두의 결함이있는 염색 및 발육 부진을 보여줍니다.
이는 망막 체외이식편이 접혀서 배양 플레이트에서 올바르게 배향되지 않았기 때문입니다. 망막이 위쪽을 향하도록 외식편의 적절한 방향에 큰주의를 기울여야합니다. 대조군이 처리군과 동일한 단일 동물에서 유래되는 것을 갖는 것은 상이한 실험 조건의 보다 신뢰성 있는 비교를 갖는 것을 갖는 것을 큰 이점으로 한다.
망막 임플란트는 당뇨병성 망막증 및 퇴행성 망막 질환과 같은 다양한 망막 질환에 대한 가능한 치료 표적을 조사하기 위한 적절한 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
