세포 주기 정지는 조혈 줄기 세포의 중요한 특징입니다. 이 프로토콜은 거의 생리적 조건하에서 체외에서 정지 인간 HSCs의 행동을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 프로토콜을 사용하여, 연구원은 동물 모형을 사용하지 않고 확장 가능한 방식으로 HsC의 분화뿐만 아니라 세포 주기 상태를 조절하는 각종 화합물, 양분, 또는 단백질의 효력을 시험할 수 있습니다.
항암제는 정지성 HSC와 사이클링 선조의 생존에 다양한 영향을 미칩니다. 이 프로토콜은 정지성 HSC 또는 세포경색 줄기 세포를 선택적으로 손상시키는 에이전트를 여는 에이전트를 찾을 수 있게 합니다. 다쿠보 연구소의 선임 연구원인 고바야시 히로시(Hiroshi Kobayashi)가 절차를 시연합니다.
시작하려면 밀리리터 나트륨 팔미타트 당 16 밀리그램, 밀리리터 나트륨 올레아테 당 30 밀리그램, 유리 튜브의 메탄올에 밀리리터 콜레스테롤 당 4 밀리그램을 녹입니다. 지질 용액을 음의 섭씨 30도에 저장하고 사용하기 전에 해동하십시오. 신선한 유리 튜브에서 지질 솔루션을 혼합하여 밀리리터 팔미티타트 당 100 마이크로그램, 밀리리터 올레야트당 100 마이크로그램, 밀리리터 콜레스테롤당 20 마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.
지질 용액을 통해 질소 가스를 전달하여 메탄올을 증발시다. 37°C의 수조에 유리 튜브를 가열하여 남은 메탄올을 완전히 증발시다. HEPES 및 글루타민으로 DMEM/F-12 배지를 준비하십시오.
페니실린과 연쇄절제술황산염을 첨가하여 밀리리터당 50대와 마이크로그램의 최종 농도를 유지합니다. 매체는 적어도 2 개월 동안 섭씨 4도에서 저장할 수 있습니다. HEPES 및 글루타민을 사용하여 DMEM/F-12 배지에 BSA의 4%를 추가한 다음 수산화 나트륨 용액을 사용하여 중간 크기의 pH를 7.6으로 조정합니다.
지질과 유리 튜브에 매체를 추가합니다. 초음파 처리로 지질을 완전히 녹입니다. 음속 처리 후 매체가 불투명한 경우 초음파 처리 시간을 연장합니다.
BSA와 지질이 용해되면 샘플을 음의 80°C로 저장하고 2개월 이내에 사용해야 합니다. 인슐린, 트랜스퍼린, 셀레니트 나트륨 및 에탄올 아민 혼합물을 DMEM/F-12에 넣고 0.22 마이크로미터 필터를 사용하여 혼합 배지를 필터링합니다. 사용하기 전에, 인간 줄기 세포 인자 또는 SCF 및 인간 혈전포이에틴 또는 TPO를 각각 밀리리터 당 3 나노그램의 최종 농도로 배양 매체에 추가한다.
이전에 준비된 배양 매체의 마이크로리터 200개를 사이토카인을 평평한 바닥 96웰 플레이트로 옮긴다. 매체의 증발을 피하려면 사용되지 않는 모든 우물을 PBS 100~200마이크로리터로 채웁니다. 마이크로리터 당 60 세포에서 사이토카인없이 배양 배지에서 정렬 된 조혈 줄기 세포 또는 HSC를 다시 중단합니다.
각 우물에 알리 쿼트 600 세포. 300개 미만의 세포는 영양 부족이나 불리한 사이토카인 또는 케모킨의 축적으로 인해 단일 우물에서 1, 000개 이상의 세포를 더 큰 기술적 변화와 배양으로 이어질 것입니다. 이산화탄소 5%와 산소 대기에서 섭씨 37도에서 가습된 다중 가스 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
정제된 HSC를 배양한 지 7일 후, 세포의 최대 80%가 마커 CD34 양성 및 CD38 음성 표현형을 표시하였다. 총 세포 수는 사이토카인 농도에 의존했다. SCF와 TPO의 높은 농도는 세포 주기, 증식 및 분화로의 진입을 유도했다.
마커 CD34 양성, CD38 음수, CD90 양성 및 CD45 RA 음성 표현형이 특징인 표현형 HSC의 수는 SCF 또는 TPO 농도에 비례하여 증가된 반면, 전체 세포 중 주파수는 감소하였다. 배양 된 성인 골수 HSC의 이식 3 개월 후, 재구성은 인간 CD45 양성 murine, CD45 음성 Ter119 음성 세포의 말초 혈액에서 주파수의 함수로 평가 될 수있다. CD19 양성 B 세포, CD13 음성, CD33 양성 골수성 세포 및 CD3 양성 T 세포를 포함한 3개의 계보가 새롭게 해동되거나 배양된 HSC로 이식된 NOG 마우스에서 재구성되었다.
다음 배양, HSC는 실시간 PCR 및 RNA 염기서열분석과 같은 유전자 발현 프로파일링을 실시할 수 있다. 면역 결핍 마우스로 이식을 이용한 기능적 검증도 수행될 수 있다. 연구원은 직접 사이토카인 농도조정하여 정의된 조건하에서 사이클링과 정지 HSC를 비교할 수 있습니다.
이것은 생체 내 설정에서 테스트하기 어려운 정지 HSC 특정 자기 갱신 프로그램, 스트레스 저항 메커니즘 및 신진 대사 특성을 이해하는 데 도움이 될 것입니다.
