생체 외 배양은 조혈 줄기 및 전구 세포의 재증식 잠재력을 방해할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 배양 중 줄기를 보존하여 생체 내에서 유전자 변형 세포의 빈도를 개선합니다. 조혈모세포 유전자 치료는 현재 단일성 질환 및 HIV와 같은 전염병에 사용되고 있습니다.
HSPC 유전자 치료 프로토콜은 생체 외 배양에 크게 의존합니다. 당사의 프로토콜은 생체 외 배양을 사용하는 모든 절차와 호환되어야 합니다. 이 프로토콜을 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Vigneshwaran Venkatesan이 될 것입니다.
HSPC를 분리한 후 사이토카인과 소분자 레스베라트롤, UM729 및 스템레게닌1을 포함하는 줄기세포 배양 배지에서 배양합니다. 유전자 편집 전에 써모믹서를 섭씨 37도로 설정하여 가이드 RNA를 재구성한 다음 TE 버퍼를 섭씨 37도에서 10분 동안 예열합니다. 합성 화학적으로 변형 된 sgRNA 바이알을 섭씨 4도에서 1 분 동안 11, 000 회 g로 원심 분리하고 1.5 나노 몰의 동결 건조 된 sgRNA가 들어있는 바이알에 15 마이크로 리터의 TE 버퍼를 첨가하고 부드럽게 소용돌이 치며 혼합하여 마이크로 리터당 100 피코 몰의 최종 농도를 얻습니다.
ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 30-40 초 동안 최소 흔들림으로 바이알을 배양하십시오. 측면에 있는 바이알을 부드럽게 두드리고 바이알을 돌려 15마이크로리터의 sgRNA를 수집합니다. 1 마이크로 리터 분취량을 만들어 섭씨 영하 80도에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
핵형성의 경우, 200배 g에서 상온에서 5분 동안 원심분리하여 5번째 세포에 10번 펠렛을 2번 올렸다. 상청액이 폐기되면 펠릿을 20 마이크로리터의 완충액에 재현탁합니다. 세포 현탁액을 준비된 RNP 복합체와 부드럽게 혼합하여 기포를 피하십시오.
이제 현탁액을 상용 뉴클레오펙션 스트립으로 옮기고 펄스 코드 DZ-100을 선택하여 4D-뉴클레오펙터를 사용하여 세포를 전기천공합니다. 뉴클레오펙션 스트립의 전기천공된 세포에 100마이크로리터의 사전 배양된 배양 배지를 추가하고 실온에서 10분 동안 세포를 방해받지 않고 그대로 둡니다. 배양이 끝나면 실험 요구 사항에 따라 내용물을 배양 용기로 옮깁니다.
NSG 마우스를 HSPC 이식 6 내지 8시간 내에 파이 케이지에 넣는다. 시판되는 조사기를 사용하여 마우스를 3.5 회색으로 조사한다. NBSGW의 경우, HSPC 이식 48시간 전에 체중 킬로그램당 12.5 밀리그램의 용량으로 부술판을 복강내 주사하여 6 내지 8주령의 수컷 및 암컷 마우스를 예비조건화하였다.
마우스 1마리를 주입하기 위해, 5번째 세포를 1.5밀리리터 튜브에 6회 10번 펠릿으로 200회 g에서 5분간 원심분리한다. 실온에서. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 부드럽게 피펫팅하고 세포 펠릿을 100마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다.
사전 조절된 NSG 또는 NBSGW 마우스를 마우스 억제기에 넣고 꼬리 정맥 주사로 HSPC를 주입합니다. 마우스 꼬리를 잡고 플러그를 부드럽게 밀어 마우스를 제지합니다. 70 % 에탄올로 마우스 꼬리를 부드럽게 닦으십시오.
31 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 흡인합니다. 이제 적외선 램프의 빛을 꼬리로 30-40 초 동안 향하게하여 마우스의 몸 부위를 티슈 페이퍼 주름으로 덮습니다. 주사기로 대패 축에 꼬리를 유지하려면 왼쪽 집게 손가락으로 들어 올리십시오.
바늘의 베벨 부분을 왼쪽 또는 오른쪽 꼬리 꼬리 정맥에 20도 각도로 부드럽게 삽입하십시오. 플런저를 밀어 세포 현탁액을 정맥에 주입하고 티슈 페이퍼로 피어싱 부위 근처에 부드러운 압력을 가하고 바늘을 빼냅니다. 마취 후 동물을 복부 누운 자세에 놓고 쥐를 부드럽게 긁어 눈을 뜨면 눈의 지구가 약간 튀어 나오도록합니다.
목초지 피펫을 30-45도 각도로 니팅 멤브레인 아래 눈의 내측 캔서스에 부드럽게 삽입합니다. 파스퇴르 피펫을 적절한 위치에 놓은 후 튜브에 약간의 압력을 가하고 튜브를 부드럽게 회전시키기 시작합니다. 50-80 마이크로 리터의 말초 혈액을 수집 한 후 눈의 내측 칸투스에서 피펫을 부드럽게 빼냅니다.
안락사 후 요도에서 1cm 위에 수직 절개를하고 횡격막 아래 1cm까지 연장하십시오. 절개 부위의 모서리를 수평으로 잘라 복부를 엽니 다. 대퇴골과 경골을 해부 한 후 가위를 사용하여 대퇴골과 경골에 부착 된 연조직을 제거하고 티슈 페이퍼로 뼈를 부드럽게 문지릅니다.
메스를 사용하여 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브의 바닥에 직경이 0.2cm 이하인 작은 구멍을 만드십시오. 메스를 사용하여 뼈의 근위 끝을 제거하고 절단면이 0.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브의 구멍을 향하도록 뼈를 놓습니다. 이제 100 마이크로 리터의 멸균 PBS가 들어있는 1.5 밀리리터 튜브에 뼈가있는 0.5 밀리리터 튜브를 놓습니다.
뚜껑을 닫고 실온에서 멸균 조건에서 3 분 동안 200 회 g으로 튜브를 돌리고 빈 골수 구멍이있는 뼈가 들어있는 0.5 밀리리터 튜브를 버립니다. 골수가 들어있는 1.5 밀리리터 반응 튜브에 1 밀리리터의 PBS를 넣은 다음 1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 10 번 부드럽게 재현탁시킵니다. 1 밀리리터의 세포 현탁액을 9 밀리리터의 적혈구 용해 완충액이 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
2 분마다 튜브를 부드럽게 뒤집어 7 분 동안 얼음에서 세포를 배양하십시오. 인큐베이션 후, 튜브를 실온에서 5분 동안 200회 g으로 원심분리하고, 투명한 옅은 백색 펠릿이 관찰될 때까지 세척을 반복한다. 살아있는 세포 및 CD34 양성, CD90 양성 세포의 빈도는 핵 형성 48 시간 후에 RUS 그룹에서 증가했다.
72시간 후, DMSO 처리군에 비해 RUS-처리된 군에서 인델의 백분율 및 빈도가 증가하여 유전자 편집의 증가를 시사하였다. CD34 양성, CD90 양성 세포 및 총 유핵 세포의 절대 수는 편집 후 48 시간에 상당히 높습니다. NSG 마우스에서 인간 CD45 양성 세포의 유세포 분석 결과는 배양 조건에서 증가 된 생착을 보였다.
마우스 BM 세포에서 유전자 편집 빈도를 분석한 결과, RUS 보충 배양 조건에서 유전자 편집 HSPC의 생착이 증가한 것으로 나타났습니다. HSPC를 mL 당 200, 000 세포의 합류점에서 배양하는 것은 기능적 줄기 세포를 개선하는 데 중요합니다. 제대혈 줄기 세포와 iSPC 유래 줄기 세포를 증폭하는 것은이 프로토콜이 테스트되는 새로운 영역입니다.
