저자는 질량 교정 및 데이터 처리에 대한 가치있는 토론을위한 데틀 레프 슈만, 제니퍼 서튼 (써모 피셔 과학)와 나다니엘 스나이더 (펜실베니아 대학)을 인정하고 싶습니다. 이 책에서보고 된 연구는 상 수 R00CA168997에서 건강의 국립 연구소의 국립 암 연구소에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1. LC-MS 시약, 크로마토 그래피 방법의 설립 준비 및 장비 운영 절차 수립 <ol><li> LC 용제의 제조 <ol><li> 500 ㎖의 이동 단계를 준비​​합니다. 20 mM의 아세트산 암모늄 및 3 % 아세토 니트릴 / 물에 15 mM의 수산화 암모늄, 최종 pH 9.0이고; B는 100 % 아세토 니트릴이다. </li><li> 느슨하게 병을 모자 물 목욕 초음파 분쇄기에 배치하고, 별도의 난방없이 10 분 동안 초음파 처리. (이 단계는 암모늄염의 모두가 완전히 용해 있고 잔류 기포가 없다는 것을 보장하는 것이다.) </li><li> LC-MS 사용을위한 250 ㎖의 유리 병에 용매, 4 ℃에서 나머지를 계속 전송 250 ML </li></ol></li><li> 낮은 질량 범위의 보정 용액을 준비합니다. 그것은 그 정확한 질량이 낮은 분자량에 감지하기 위해 대사 체학 응용 프로그램에 대한 사용자 정의 낮은 질량 범위의 보정 혼합물을 사용하는 것이 중요합니다. <ol><li> 소디 모두 5 ㎎의 무게를UM fluoroacetate 및 homovanillic 산 및 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 만들어 5 ml의 물에 그들을 용해. 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 만들기 위해 메탄올에 녹여 디아 지논. </li><li> 음의 낮은 질량 교정 액 1 ㎖를 제조하고 나트륨 fluoroaceate homovanillic 믹산 용액 20 ㎖와 함께 항온 마이너스 보정 용액 960 ㎖를 혼합한다. 양의 낮은 질량 보정 용액 1 ㎖를 만들려면, 열 양의 보정 용액 990 ㎖ 및 10 ㎖ 다이아 지논 솔루션을 섞는다. (낮은 질량 교정 솔루션은 4 ° C에서 보관해야하고 2 개월마다 신선한 준비합니다.) </li></ol></li><li> 낮은 질량 범위에서 QE-MS의 교정 <ol><li> 낮은 질량 범위의 보정을 수행하기 전에, 제조업체의 지침에 따라 긍정과 부정 두 가지 모드에서 표준 질량 교정 (M / Z, 150-2,000)을 수행한다. </li><li> 일반 대중의 교정이 통과되면, 인스트루먼트 컨트롤 패널에서 60~900m / Z까지 검색 범위를 조정긍정적 인 모드와 음의 모드에 대한 35 eV의 25 EV의 소스 CID이 적용됩니다. (이것은 카페인 조각 이온과 황산 이온의 강력한 신호를 제공 할 것입니다. 여기에 스캔 범위가 고정되어, 마지막 m / z는 시작 M / Z의 15 배 이상 클 수 없습니다해야하기 때문에) </li><li> 이온 소스가 안정되면, 다음 사용자 정의 교정을 수행합니다. 참고 : 안정된 소스는 포지티브 모드에서 총 이온 전류 변화의 10 % 미만으로 정의하고, 네거티브 모드에서의 15 % 미만. 맞춤형 교정 이온 및 대응하는 m / z를 표 1에 나타내었다. </li></ol></li><li> 극성 대사 산물 분석을위한 LC-MS 계측을 설정합니다. LC는 대사 산물의 분리 및 검출을 위해 QE-MS에 연결된다. <ol><li> 온수 전기 분무 이온화 프로브 (H-ESI)와 QE-MS 장비. 나열된 프로브 관련 조정 매개 변수 설정 : 히터 온도 120 ° C를; 시스 가스, 30; 보조 가스, 10; 가스, 3을 청소; 전압 3.6 kV의 스프레이긍정적 인 모드와 음의 모드 2.5 kV의. 55에서 320 ° C에서 모세관 온도, S 렌즈를 설정합니다. </li><li> 전체 검색 범위 : 다음과 같이 전체 검사 방법을 구축 60-900 (M / Z)를; 해결책 : 70,000; 최대 주입 시간 : 50 밀리 초 정도의 전형적인 주입 시간이 200 밀리 초; 자동 이득 제어 (AGC) : 3,000,000 이온. 이러한 설정은 양 및 음 양쪽 모드에서 스캔을 수행하기 위해 주변의 550 밀리의 듀티 사이클을 초래한다. </li><li> 크로마토 그래피 방법을 설정합니다. 실내 온도 13, 15의 화합물 분리 아미드 칼럼 (100 × 2.1 mm 내경 3.5 mm)를 사용한다. 전술 한 바와 같이 이동상이고, 이동상 B는 아세토 니트릴이다. 다음과 같이 선형 그라데이션을 사용하여 0 분, 85 % B를; 1.5 분, 85 % B, 5.5 분, 35 % B; 10 분, 35 % B, 10.5 분, 35 % B, 14.5 분, 35 % B, 15 분, 85 % B, 20 분, 85 % B. 유속 0.15 ㎖ / 분 0-10 분 및 15의 20 분, 10.5에서 14.5 분에 0.3 ㎖ / 분이다. </li></ol></li></ol> 2. 홍보대사 산물의 샘플의 eparation <ol><li> 추출 용매를 준비합니다. 50 ML 튜브에 40 ㎖의 메탄올 (LC-MS 급) 및 10 ㎖의 물 (LC-MS 급)를 혼합하고, 사용하기 전에 적어도 1 시간 동안 -80 ° C 냉동고에 보관합니다. 참고 :이 절차와 다음 단계는 생체 조직과 유체 샘플의 추출을 위해 변경 될 수있다. <ol><li> 전체 성장 매체와 세 10cm 접시 6 - 웰 플레이트에 문화 대장 암 HCT 8 세포는 RPMI 1640 10 % 열 불 활성화 태아 혈청과 10 만대 / L 페니실린 및 100 ㎎ / L 스트렙토 마이신과 보충. </li><li> 세포가 80 %의 합류에 도달하면, 신속하게 미디어를 제거하고, 드라이 아이스 (13, 15)의 상단에있는 접시 또는 접시를 놓습니다. 즉시 (80 % 메탄올 / 물) 용매 1 ㎖의 추출을 추가하고, -80 ° C 냉동고에 플레이트를 전송합니다. 10cm 접시를 들어, 각 웰에 추출 용매 3 ㎖를 추가합니다. (중간 길이 중간에서 잔류 염에 의한 이온 억제 효과를 피하기 위해 가능한 한 많이 제거하십시오.)</li><li> 15 분 동안 접시를 둡니다. 냉장고에서 제거하고, 드라이 아이스의 용매에 세포를 다 쳤어요. 1.7 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 대한 해결책을 전송하고, 10 분 동안 4 ° C에서 20,000 XG의 속도로 원심 분리기. (세 개의 복제 샘플을 만들기 위해 별도의 세 가지 요리에서 세포 대사를 준비합니다. 두 개의 튜브를 유지의 목적은 백업으로 한 것입니다.) </li><li> 두 개의 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 전송하고, 속도 진공을 건조. 이 사용 속도 진공에 따라 약 3-6 시간이 걸립니다. (샘플은 질소 하에서 밤새 건조 될 수있다.) </li><li> -80 ° C 냉동고에 각 시료의 건조, 저장 튜브 후. 준비가되면, 20 ㎖의 물 (LC-MS 등급)에 하나의 샘플을 재구성 및 분석을위한 LC-QE-MS에 5 ㎖를 주입. </li></ol></li></ol> 샘플 시퀀스 3. 설치 <ol><li> 교정이 적절 QE-MS상에서 수행되면, 유동에서 85 %와 5 분 동안 LC 컬럼을 평형화LC의 그라데이션의 시작 조건입니다 0.15 ㎖ / 분의 속도. </li><li> 무작위로 샘플 순서를 설정합니다. 주 :이 방식으로, 각 샘플에 LC-MS에 의해 도입 변동을 분배하고 상이한 샘플 사이의보다 정확한 비교를 보장한다. LC 구배를 10 분 동안 95 %이고, 0.15 ㎖ / 분의 유속으로 85 %에서 5 분 칼럼 평형화 하였다 제외한 모든 6 샘플은, 동일한 MS 방법을 주 워쉬 실행을 추가. 시스템의 배경을 평가 레벨에 수행하는 각 세척 실행 후 빈 샘플 (100 % 물)를 추가합니다. </li><li> 순서를 저장하고 LC 열이 400 PSI 정도 안정 압력을 표시하면, 시퀀스 실행을 시작합니다. 다른 샘플은이 시퀀스 이후에 실행되도록 거기 없으면 끝나면 다음 그라데이션의 끝에서 0 ml / 분의 유량을 갖는 시퀀스의 끝에서 정지 주행을 추가하고 &quot;대기&quot;를 선택 순서. </li><li> 다시 실행 동일한 샘플을 보정 한 후에 12 시간을 설정합니다. (이 전보정 후의 질량 에러 변동을 평가하는 발.) </li></ol> 4. 포스트 분석 기기 청소 및 유지 보수 <ol><li> 시퀀스의 끝에서, 0.2 시간 동안 2 ml / 분의 유속으로 95 %로 컬럼을 세척하고, 필요한 경우, 세척하기 전에 열을 역방향. </li><li> LC 열을 제거하고 직접 조합하여 이온 소스에 LC를 연결합니다. 용매, 물 / 메탄올 / 포름산 청소 준비 (v를 : V : V, 90:10:0.2), 대기 모드에있는 MS를 설정하고, 0.1의 유속으로 세척 LC-MS 시스템 ㎖ / 분에서 1 시간 동안 제거 잔류는 염 또는 다른 불순물을 침전. 너무 많은 시스템 압력이 있으면 유량을 낮추. </li><li> 50 ° C에서 모세관 온도를 설정하고, 이온 케이지를 제거합니다. 모세관 온도가 50 ° C로 인하 한 후 조심스럽게 이온 청소 콘 및 이온 전달 튜브를 꺼내 이온 스위프 콘의 표면에 남아있는 불순물을 제거하기 위하여, 샌드페이퍼로서, 거친 메쉬를 사용. </li><li> 이온의 이동 배치0.1 % 포름산 10 ml의 90 % 물 / 메탄올을 함유하는 15 ㎖의 팔콘 튜브에 관. 20 분 동안 수욕에서 초음파 분쇄기의 튜브를 초음파 처리 한 후, 내부에 용매를 가만히 따르다 10 ㎖의 순수 메탄올로 교체하고 또 다른 20 분 동안 초음파 처리. (필요한 경우, 초음파는 40 °의 C 또는 더 나은 청소 결과를 달성하기 위해 더 높은 온도에서 수행 될 수있다.) </li></ol> LC-MS 데이터 5. 분석 <ol><li> 샘플 서열을 확인하기 위하여 시퀀스에서 첫 번째 두 개의 샘플을 마친 후 불명 대사에 대한 피크를 검사, 원활하게 실행. 대사 이름, 중립 화학식 및 탐지 모드 (양수 또는 음수), 입력 파일로, 출력 파일을 압축 해제 한 봉우리와 ppm의 질량 오류가있는 목록을 CSV 파일을 사용합니다. 피크 형태는 비정상 또는 질량 오차가 5ppm 이하로 떨어져 있다면, 시퀀스의 나머지를 정지하고, 문제가 수행되어야 할 필요가있다. </li><li> &quot;피크 정렬 방법을 선택합니다및 상용 소프트웨어에 프레임 추출 &quot;. LC-MS와 그룹들을 원시 데이터를 선택합니다. 피크 정렬을위한 크로마토 그래피 기준 샘플과 실행 시퀀스의 중간에 샘플을 선택합니다. 수집 된 데이터와 표적 대사 산물 분석 및 해당 프레임 시드 공지 대사 산물을 포함하는 프레임을 올려 시드. </li><li> 개별적으로 긍정과 부정 모드에서 데이터 분석을 수행합니다. 다른 매개 변수에 대한 기본 설정을 사용합니다. 데이터베이스 검색 기능을 해제하고 워크 플로를 실행합니다. 모든 프레임의 피크 면적을 포함하는 엑셀 시트로 처리 된 데이터를 내 보냅니다. 프레임의 첫 번째 세트는 타겟 목록의 대사에 대응한다. 참고 : 표적 대사 분석을 위해 대사 산물 정보는 이전 연구 13,15에 기초하여 획득된다. </li><li> 타겟이 불분명 한 대사 산물 분석을 위해, &quot;구성 요소의 추출&quot;의 방법을 선택합니다. 배경 빼기 빈 샘플을로드합니다. 설정된 피크 세기 임계t 10 5, 3의 잡음 비율 10 PPM 신호의 M / Z 폭. </li><li> 알 수없는 화합물의 식별을 위해 인간의 대사 체 데이터베이스를 사용합니다. 복제 샘플에서 큰 CVS를 사용하여 구성 요소를 제거하기 위해 CV 필터를 사용합니다. 수동으로 각 구성 요소를 통과하고 잘 정의 된 피크 또는 데이터베이스 검색을위한 다양한 샘플 종류의 비교적 큰 차이를 가진 사람을 선택합니다. 데이터베이스의 히트 곡 데이터를 내 보냅니다. (피크 정렬 점수가 너무 낮은 경우 픽 배향이 무시 될 수있다.) </li></ol>

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저자는 관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜을 이용하여 세포의 성공적인 대사 산물 프로파일 링을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 성장 배지와 세포의주의 추출을 제어하는​​ 단계; 2) 정량 피크 걸쳐 충분한 (보통 적어도 10) 데이터 포인트가되도록 MS 방법 설정에 근거 LC 방법을 조정하는 단계; 3) 샘플을 실행하기 전에 낮은 질량 교정을하고; 4) 이동 유지 시간을 피하기 위해 더 이상 5 이상 ㎖에 주입 피크 폭이 넓?...

동시에 여러 대사 산물을 측정하는 실험으로 정의 대사는 강렬한 관심의 영역이었다. 대사는 분자 생리학의 직접 판독을 제공하고 암 1-4으로 개발 및 질병에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 핵 자기 공명 (NMR) 및 가스 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (GC-MS)은 가장 일반적으로 사용되는 악기 5-9들이다. NMR, 특히 13 C라는 대사 무거운 동위 원소 표지 화합물, 이후 플럭스 실험에 사용 된 10, 11 NMR 활동이다. 그러나,이 전략은 대사에서 해당 응용 프로그램을 제한하는, 상대적으로 높은 샘플의 순도와 큰 샘플의 양을 필요로한다. 한편, NMR에서 수집 된 데이터를 집중 분석하고 복잡한 NMR 스펙트럼의 복합 할당이 곤란합니다. GC-MS는 광범위 극성 지질 대사 연구를 위해 사용되었지만, 그것은 휘발성 compoun을 필요DS 때로는 시간이 소요될 수 있습니다 복잡한 화학을 포함하고 실험적인 노이즈를 소개 대사 때문에 자주 유도체. 셋째 중극은 특성상 단편이나 딸 이온을 선택하는 데 사용되는 동안 삼중 사중 극 질량 분석계에 연결된 액체 크로마토 그래피 (LC)은, 다음 제 중극 조각화되어 본래 부모 이온을 선택하기위한 제 중극을 사용한다. 특정 딸 이온에 부모 이온의 전환을 기록하는이 방법은, 여러 반응 모니터링 (MRM)으로 불린다. MRM은 작은 분자와 단백질 정량 12-15,21 모두에게 매우 민감한 특정하고 강력한 방법입니다. 그러나, MRM은 한계가 있습니다. 높은 특이성을 달성하기 위해 MRM 방법은 각각의 대사에 구축 할 필요가있다. 이 방법은 특정 단편을 식별하고 prope의 사전 지식을 필요로 최적 충돌 에너지를, 대응 이루어져이러한 화학 구조 정보로서 그 대사 산물의 rties. 따라서, 일반적인 조각의 중립적 인 손실을 포함하는 몇 가지 예외를 제외하고,이 방법으로 알 수없는 대사를 식별 할 수 없습니다. 최근 몇 년 동안, 고해상도 질량 분석 (HRMS) 악기는 LTQ-orbitrap 및 Exactive 시리즈, QuanTof로 발표 및 TripleTOF 5600 16-18,22되었습니다. HRMS는 수 ppm의 오차 내에서 그대로 이온의 비율 (M / Z)를 충전하는 질량을 제공 할 수 있습니다. 따라서 모든 프리 커서 이온 (즉, 풀 스캔 모드)를 검출하여 조작 HRMS 악기 정확한 질량 분석의 결과 원소 조성으로부터 직접적인 구조 정보를 얻을 수 있고,이 정보는 잠재적 인 대사를 식별하기 위해 사용될 수있다. 실제로, 화합물에 대한 모든 정보는 구조적 이성질체의 레벨까지, 정확한 질량으로 얻을 수있다. 또한, 전체검사 방법은 대사 산물의 이전 지식을 필요로하지 않습니다 및 방법의 최적화가 필요하지 않습니다. m / z는 스캔 범위에 떨어지는 모든 이온을 분석 할 수 있기 때문에 또한, HRMS는 MRM 방법에 비해 단일 ​​실행 정량화 할 수있는 대사 산물의 수의 측면에서 거의 무제한의 용량을하고있다. HRMS 인해 스캔 전체 MS에서 얻어 질 수있는 데이터 포인트의 수를 비교 결과로 짧은 듀티 사이클에 또한 정량적 용량 삼중 사중 극 MRM에 대등하다. 따라서, HRMS 양적 대사에 대한 대체 방법을 제공합니다. 최근 HRMS의 개선 된 버전 (QE-MS)가 검출 영역 (19)을 확장 한 방법으로서, 충분히 빠른 사이클 시간과 양 및 음의 모드 사이의 전환에 따라 동작 될 수 Q-Exactive 질량 분석법을 칭했다. 여기서 우리는 QE-MS를 사용하여 우리의 대사 전략을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 그러나, 현재의 플랫폼은 노동 집약적 샘플 준비, 낮은 검출 한계, 느린 검색 속도, 각 대사 산물에 대한 집중적 인 방법의 최적화 및 긍정적를 모두 측정 할 수 없다는 단일 실험에서 음으로 하전 된 이온과 같은 다른 제한 요인을 보유하고 있습니다. 따라서, 새로운 대사 프로토콜은 대사 체학 연구를 앞당길 수있다. 아미드 계 친수성 ​​크로마토 그래피는 화학 유도체없이 극성 대사 산물 분석을 가능하게한다. Q-Exactive (QE-MS)를 사용하여 고해상도 MS는 이온 광학 향상된 스캔 속도 (해상도 70,000 256 밀리 초)을 증가하고, 양 / 음 전환을 수행하는 기능을 가지고있다. 냉 메탄올 추출 전략을 사용하고, QE-MS와 아미드 열을 결합하는 동시에 추가 기능의 168 대상 극성 대사 물질 및 수천의 강력한 탐지 할 수 있습니다. DAT가공이 매우 효율적인 방식으로 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 수행되고, 질량 스펙트럼에서 추출 불명의 특징 데이터베이스에 쿼리 할 수​​있다.

대사 체학 데이터의 정확성이 높은 LC-QE-MS 기기의 성능에 따라 달라집니다. 악기가 좋은 상태에서 작동 여부를 평가하고, 그림 1과 같이 적용 방법은 적절한인지, 몇 가지 알려진 대사 LC 피크, 총 이온 크로마토 그래피 (TIC)에서 추출됩니다. 아미노산을 포함하여 극지 대사, 작용의 중간체 , TCA 중간체, 핵산, 비타민, 등등 ATP, NADP +와 현재 LC 조건 하에서 아미드 열에서 열 및 좋?...

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A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K 조회수.  Cornell University.  대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다. 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Metagenomic 도서관 대규모 화면

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

연구

생물학

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

전체 몽키 브레인에서 대규모 단백질 탐지에 대한 배치 Immunostaining

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

대규모 Zebrafish 기반 생체내에서 작은 분자 화면

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

대규모 SNP 유전자형 응용 프로그램에 대한 Infinium 분석

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. Exosomes for clinical application require large-scale production. To this aim, human synovial fluid MSCs (hSF-MSCs) were grown on microcarrier beads, and then cultured in a dynamic three-dimension (3D) culture system. Through utilizing 3D dynamic culture, this protocol successfully obtained large-scale exosomes from SF-MSC culture supernatants. Exosomes were harvested by ultracentrifugation and verified by a transmission electron microscope, nanoparticle transmission assay, and western blotting. Also, the microbiological safety of exosomes was detected. Results of exosome detection suggest that this approach can produce a large number of good manufacturing practices (GMP)-grade exosomes. These exosomes could be utilized in exosome biology research and clinical osteoarthritis treatment.

Here, we present a protocol to produce a large number of GMP-grade exosomes from synovial fluid mesenchymal stem cells using a 3D bioreactor.

3D 생물반응기 배양에 의한 활액 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀의 대규모 제조

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

A Robust Method for the Large-Scale Production of Spheroids for High-Content Screening and Analysis Applications

High-content screening (HCS) and high-content analysis (HCA) are technologies that provide researchers with the ability to extract large-scale quantitative phenotypic measurements from cells. This approach has proved powerful for deepening our understanding of a wide range of both fundamental and applied events in cell biology. To date, the majority of applications for this technology have relied on the use of cells grown in monolayers, although it is increasingly realized that such models do not recapitulate many of the interactions and processes that occur in tissues. As such, there has been an emergence in the development and use of 3-dimensional (3D) cell assemblies, such as spheroids and organoids. Although these 3D models are particularly powerful in the context of cancer biology and drug delivery studies, their production and analysis in a reproducible manner suitable for HCS and HCA present a number of challenges. The protocol detailed here describes a method for the generation of multicellular tumor spheroids (MCTS), and demonstrates that it can be applied to three different cell lines in a manner that is compatible with HCS and HCA. The method facilitates the production of several hundred spheroids per well, providing the specific advantage that when used in a screening regime, data can be obtained from several hundred structures per well, all treated in an identical manner. Examples are also provided, which detail how to process the spheroids for high-resolution fluorescence imaging and how HCA can extract quantitative features at both the spheroid level as well as from individual cells within each spheroid. This protocol could easily be applied to answer a wide range of important questions in cell biology.

This protocol details a method for the production of three different types of spheroids in a manner that makes them suitable for large-scale high-content screening and analysis. In addition, examples are presented showing how they can be analyzed at spheroid and individual cell levels.