안녕하세요, 저는 양저우 대학의 카이 진입니다. 우리 연구 그룹을 대신하여 나는 발달 연구에서 닭 배아의 강력한 도구를 제시 할 것입니다. 닭 배아는 발달과 분화를 조사하는 데 사용 된 고전적인 발달 모델이며, 실제로 닭 배아에 대한 실험실의 외래 측정은 유전자 형질감염, 형질전환 육종 및 생식선 횡단 준비와 같은 발달 생물학을위한 귀중한 도구입니다.
우리 실험실에서는 mu 형 주입 방법을 확립했지만 많은 연구자들에게 주사의 세부 사항은 불분명하고 정렬하기가 어렵습니다. 그래서이 비디오에서, 우리는 오보에서 닭 배아 발달의 초기 단계에서 혈관 주입의 세부 사항을 보여줄 것입니다. 당신이 그것에 흥미있는 경우에 저희에게 연락하게 자유롭게 느끼십시오.
여기에서는 프로토콜의 세부 정보를 보여줍니다. 수정 된 난자 수집 및 준비. 첫째, 포유류와 달리 닭은 단일 난소에 수백만 개의 난포를 가지고 있지만,이 난포 중 일부만이 배란하기에 충분히 성숙합니다.
각 여포에는 하나의 난모세포 또는 생식 세포가 들어 있습니다. 난포가 성숙하고 노른자를 방출하자마자 나팔관의 깔때기에 통합됩니다. 난관의 경정맥 복부에 들어가면 정액이 암탉의 몸에있는 난자에 결합하고 암탉의 몸에있는 칼슘은 수정 된 난자를 감싸는 껍질을 형성하여 몸에 부드러운 껍질 알을 형성합니다.
칼슘 껍질은 계란이 생성 될 때까지 점차 두꺼워집니다. 학문적으로 배아 알이라고 불리는 수정 된 난자를 모아 섭씨 37.8도 및 습도 60 %의 인큐베이터의 랙에 깔끔하게 놓습니다. 배아는 적합한 조건 하에서 배양된다.
이틀 동안 부화 한 후에 원시적 인 심장이라고 불리는 작은 펄싱 붉은 점이 나타납니다. 이 과정을 체리 박동이라고합니다. 약 2.5 일 후에 혈관이 보이고 심장과 신체 세그먼트가 형성되었습니다.
바늘 및 플라스미드 준비. 우리는 유리 모세 혈관을 바늘로 사용합니다. 주입하기 전에 외경이 1 밀리미터이고 내경이 0.6 밀리미터 인 유리 모세 혈관을 준비하십시오.
외인성 물질은 보통 플라스미드, 패키징된 렌티바이러스 및 원시 생식 세포, 또는 PGCs이다. 이 비디오에서는 트립판 블루를 사용하여 주입 된 물질의 흔적을 보여줍니다. 윈도우. 배아를 노출시키기 전에, 우리는 세균 오염을 방지하기 위해 배아를 살균해야합니다.
이것은 계란 개구부 부위에서 75 % 알코올면으로 배아의 표면을 부드럽게 닦아서 수행됩니다. 소독 후, 포셉으로 달걀 껍질의 무딘 끝을 부드럽게 두드리고 포셉으로 달걀 껍질 표면에 0.5 센티미터 x 0.5 센티미터 구멍을 조심스럽게 잘라 배아를 노출시킵니다. 인-오보 혈관 내 주사.
현미경으로 볼 때보고 현미경의 초점을 조정하여 배아를 먼저 찾은 다음 주사 준비가 된 닭 배아의 혈관을 찾으십시오. 혈관에서 외인성 물질로 바늘을 조준하고 바늘이 주입되는 혈관과 평행하다는 점에 주목하십시오. 바늘을 혈관에 부드럽게 삽입 한 다음 공기 펌프를 켭니다.
이 시점에서 이물질은 동맥에 들어가고 심장이 뛰면서 동맥을 통해 배아로 다시 순환 한 다음 정맥으로 순환합니다. 혈관 주사에는 두 가지 유형이 있습니다. 하나는 배아의 머리에있는 정맥에서 이물질이 주입되어 심장으로 다시 흘러 들어가는 머리 주사입니다.
다른 하나는 등쪽 대동맥 주사로 이물질이 심장의 박동과 함께 배아로 순환합니다. 배아 심장의 박동과 혈액의 순환으로 우리는 이물질이 동맥 끝의 모세 혈관에 의해 정맥으로 들어간 다음 정맥에서 배아로 되돌아 간다는 것을 분명히 알 수 있으며, 이는 주입 된 이물질이 배아의 각 부분으로 효과적으로 전달된다는 것을 나타냅니다. 주사 후, 입체 현미경에서 달걀을 제거하고, 작은 가위로 세 센티미터 길이의 의료용 테이프 조각을 자르고, 테이프를 개구부에 부착하십시오.
가위로 테이프를 부드럽게 긁어 기포를 짜낸 다음 다른 테이프 조각을 잘라 개구부를 십자가로 밀봉합니다. 개구부를 밀봉 한 후, 주입 된 배아를 조심스럽게 인큐베이터에 다시 넣습니다. 여기서 우리는 주사 후 닭 배아의 대표적인 이미지를 보여줍니다.
첫 번째 이미지는 렌티바이러스 플라스미드 주사의 결과를 보여준다. 입체 형광 현미경 하의 녹색 형광은 배아에서 주입된 플라스미드의 성공적인 발현을 나타낸다. 이것은 닭 배아에 플라스미드의 혈관 내 주사의 가능성을 시사한다.
두 번째 이미지는 PGC 주입의 결과를 보여준다. PGCs를 RFP로 라벨링하였다. 이 그림에서 우리는 수령인의 생식선에 위치한 빨간색 점 인 주입 된 PGC를 볼 수있었습니다.
이것은 기증자 PGC가 수혜자의 생식선에 효과적으로 진입하고 식민지화 할 수 있었음을 나타냅니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 외인성 물질, 플라스미드 또는 PGC를 닭 배아에 혈관내 주사하는 과정을 제시한다. 여기에 표시된 방법은 따르기 쉽고 배우기 쉽고 많은 분야에서 적용 할 가치가 있습니다.
이것이 내가 당신과 나누고 싶은 전부입니다. 이 접근법이 닭 배아와 개발 생물학을 설정하는 강력한 연구 도구로서의 작업을 촉진하기를 바랍니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사 드리며 연구에 행운을 빕니다.
