정밀 절단 폐 슬라이스 방법은 지역 적 편견없이 3 차원으로 구조 와 공간 방향을 보존하고 선박 및 기도 수축 측정을위한 라이브 대리 모델로 사용될 수 있습니다. 시간 경과 화상 진찰, 서양 얼룩 및 RNA 분석과 결합하여, 정밀 절단 폐 조각은 다양한 무질서의 기초에 근거하고 폐 혈관 질병의 병리학의 더 나은 이해로 이끌어 내는 신호 캐스케이드의 포괄적인 이해에 기여합니다. 먼저 안락사된 성인 마우스를 supine 위치에 놓고 발과 코를 접착제 테이프로 테이블에 테이프로 테이프로 눌러 제자리에 고정하십시오.
70%에탄올로 마우스의 복부 표면을 분사합니다. 집게를 사용하여 방광 및 수술 가위의 위치에서 마우스의 복부 피부를 들어 올려 중간라인에서 절단하고 자궁 경부 부위로 우월하게 이동하여 기관지를 노출시합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 기본 근막 층을 들어 올리고 외과 가위를 사용하여 내장 장기와 근간 구획을 노출하고 다시 열등하게 절단하여 우수한 것으로 절단하십시오.
심장과 폐를 드러내기 위해 중간선에서 흉골을 자른다. 간 및 복부 구획에서 다이어프램을 조심스럽게 해부하십시오. 창자 아래에 열등한 베나 카바를 찾아 잘라냅니다.
오른쪽 심실을 찾은 후, 25 내지 30 게이지 나비 바늘을 사용하여 오른쪽 심실에 1%분획 된 헤파린의 0.5 밀리리터를 주입하고 PBS의 10 ~ 15 밀리미터로 천천히 그러나 꾸준히 씻어 내립니다. 후두를 찾은 후 무딘 팁 핀셋을 사용하여 주변 근막과 조직을 해부한 다음 수술 봉합사를 기관 아래에 놓고 수술 매듭을 느슨하게 묶습니다. 끈보다 우수한 기관지에 작은 구멍을 놓고 20 게이지 무딘 엔드 바늘로 캔터레이.
수술 매듭을 사용하여 바늘과 기관 주위의 봉합사를 조입니다. 그런 다음 기관으로 아가로오스 2.5 ~4 밀리리터를 주입하고 폐의 인플레이션을 모니터링합니다. 아가로즈 주입 후, 아가로즈를 고화시키기 위해 폐에 차가운 PBS를 붓습니다.
그런 다음 수술 봉합사보다 우수한 기관지를 자르고 접착및 근막을 제거하여 폐와 심장을 중진에서 해부합니다. 응고 후, DMEM에 티슈를 얼음 위에 페트리 접시에 놓고 즉시 진동 기계를 사용하여 한 엽을 자르는 것을 진행합니다. 폐 슬라이스를 준비하려면 시료를 슈퍼 접착제로 플랫폼에 부착하여 내측을 향하게 합니다.
그런 다음 샘플 용기를 PBS로 채웁니다. 주변 PBS를 유지하고 차가운 샘플을 유지하기 위해 얼음으로 용기를 채웁니다. 진동을 켭니다.
두께를 300 마이크로미터로 조정하고, 주파수를 100 헤르츠로, 진폭은 0.6밀리미터로, 초당 5마이크로미터로 속도를 조절한다. 알렌 렌치를 사용하여 블레이드 홀더를 안전한 위치로 바꾸고 턱을 열어 블레이드를 삽입합니다. 그런 다음 알렌 렌치로 턱을 조입니다.
샘플을 상자에 놓아 PBS에 침수되도록 합니다. 상자를 올바른 위치에 밀어 놓고 안전한지 확인합니다. 블레이드 홀더를 슬라이스에 적합한 위치로 바꿔놓습니다.
진동 블레이드를 블록 가장자리까지 가져와서 샘플 상단이 될 때까지 블레이드를 수동으로 낮춥습니다. 설정을 확인하고 진동을 실행합니다. 신선한 슬라이스를 절단 한 후, PBS에서 샘플을 제거하고 일회성 항mycotic 항생제를 포함하는 DMEM의 10 밀리리터와 멸균 페트리 접시에 배치합니다.
페트리 접시에 모든 조각을 넣은 후 블레이드를 완전히 철회하고 알렌 렌치를 사용하여 블레이드를 안전한 위치로 올립니다. 샘플을 섭씨 37도에 DMEM에 보관하십시오. 그리고 현미경 슬라이드에 진동 조각을 놓습니다.
클리닝 와이프를 사용하여 과도한 매체를 제거하십시오. 상 대비 현미경 검사법에 샘플을 배치하고 혈관을 식별하기 위해 10 ~ 20배 배율을 사용합니다. 그런 다음 60 밀리알륨 염화 칼륨 또는 1 개의 미세 몰린-1과 같은 혈관 수축기 500 마이크로 리터를 추가하여 슬라이드를 완전히 잠급합니다.
30~60초 동안 녹화하여 비디오를 관찰하고 캡처합니다. 실험을 시작하기 전에 작은 폴리스티렌 폼 박스에 액체 질소 1리터를 채우고 액체 질소가 있는 용기에 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브 2개를 놓습니다. 박격포 그릇에 4-5개의 신선한 진동 조각을 넣습니다.
슬라이스 위에 액체 질소 5~10밀리리터를 붓고 유봉을 사용하여 액체 질소가 증발하기 전에 조각을 분말로 분쇄합니다. 미리 차가운 강철 실험실 스쿠퍼를 사용하여 두 개의 차가운 미세 원심 분리 튜브에 분말을 스쿱하고 RNA 절연을위한 RNA 추출 시약 500 마이크로 리터 또는 단백질 용 용 RIPA 버퍼 500 마이크로 리터를 추가하여 분말을 lyse하십시오. 대표적인 생존능력 실험에서는 PCLS 슬라이스의 색상 변화가 0일에서 1일 및 10일째까지 검출되었다.
이 솔루션은 처음에는 파란색으로 되어 하룻밤 사이에 분홍색으로 변하여 생존가능성을 보여주었습니다. 색상 변경은 일반적으로 1~4시간 이내에 발생했지만 더 긴 시간이 필요할 수 있습니다. 진동방지조직을 위한 562 나노미터 파장의 흡광도와 613나노미터파장의 일일 차이는 여기에 도시된다.
내피-1 및 염화칼륨을 사용하여 진동기가 준비된 폐 조직에서 혈관의 수축을 시각화할 수 있다. 타목시펜 주입 후 1 주일 세포에서 tdTomato 라벨링의 보존은 이 폐 조각에서 입증된다. 추가 실험 및 화상 진찰 의 앞에 순환에서 모든 혈액을 제거하기 위하여 폐 정리 및 인플레이션 단계를 잘 수행하는 것이 가장 중요합니다.
혈관 질환 외에도, PCLS는 기도 관련 질병의 생리학을 연구하기 위하여 적용될 수 있고, 임상적으로 관련있는 시나리오에서 인간 폐 조직에 추가 시험될 수 있습니다.
