이 프로토콜은 네이티브 틈새 시장에서 인간 성상 세포의 분자 기능을 연구하는 데 관심이있는 과학자들을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 활성화 핵 분류를 사용하여 벌크 인간 뇌 조직 표본으로부터 특정 세포 유형, 성인 성상세포의 분리 및 농축을 허용한다는 것이다. 이 방법론은 다른 적절한 형광-접합된 항체를 사용하여 뉴런 및 희소돌기아교세포 전구 세포와 같은 인간 신피질로부터 다른 세포 유형을 단리하는데 적용될 수 있다.
신선한 냉동 인간 성인 피질 조직 샘플로부터 대략 200 내지 400 밀리그램의 조직을 해부하기 시작한다. 조직을 얼음 위에 얼음 차가운 용해 완충액 네 밀리리터가 들어있는 일곱 밀리리터 유리 조직 douncer에 넣고 조직을 약 50 번 갈아냅니다. 균질액을 12-밀리리터 초원심분리 폴리프로필렌 튜브로 옮긴다.
5 밀리리터 피펫을 사용하여 6.5 밀리리터의 얼음처럼 차가운 수크로오스 버퍼를 수크로오스와 조직 균질물 사이의 계면을 방해하지 않고 초원심분리 튜브의 바닥에 첨가하십시오. 핵을 수집하기 위해, 용해물을 101, 814배 G에서 1시간 동안 초원심분리하고, 펠렛을 방해하지 않고 상청액 및 파편을 조심스럽게 흡인한다. PBS 중 0.1%BSA를 초원심분리 튜브에 첨가하여 핵 펠릿을 재현탁시키기 전에 얼음 상에서 10분간 인큐베이션한다.
그런 다음 트리판 블루를 사용하여 광학 현미경으로 무손상 핵을 시각화하고 농도가 밀리리터 당 5 번째 핵보다 10 이상 있는지 확인하기 위해 분리 된 핵의 형광 활성화 분류를 위해 Alexa fluor 555 접합 마우스 항-NeuN 항체를 포함하는 항체 용액에 재현탁 된 샘플을 약 20 마이크로 리터를 첨가하십시오. 약 20 마이크로리터의 재현탁된 샘플을 APC 컨쥬게이션된 마우스 항-PAX6 항체를 함유하는 항체 용액에 첨가한다. 진탕으로 섭씨 네 도에서 1시간 배양한 후, 빛으로부터 보호하고, 모든 샘플 및 대조군에 1:1000 비율로 DAPI를 첨가한다.
적절한 크기의 핵을 포함하고 적혈구와 파편을 배제하려면 제어 튜브를 사용하여 전방 및 측면 산란 영역으로 세포를 게이트하십시오. 일중항 핵 집단을 선택하려면, 전방 산란 영역 대 전방 산란 폭 또는 높이 및 측면 산란 영역 대 측면 산란 폭 또는 높이에 의한 게이트. DAPI에 의한 게이트는 손상되지 않은 핵 일중항 만 포함하고 파편과 이중을 배제합니다.
임의의 추가적인 형광 대조군에 따라 게이팅한 후, DAPI 전용 대조군 샘플을 실행한다. NeuN 알렉사 플루오르 555 전용 대조군을 실행하여 알렉사 플루오르 555 채널에서 NeuN 양성 염색에 대한 컷오프를 결정한다. PAX6 APC 전용 대조군을 실행하여 APC 채널에서 PAX6 양성 염색에 대한 컷오프를 결정한다.
모든 대조군이 실행된 후, NeuN 양성 세포를 게이트하여 뉴런을 수집하고 PAX6 양성 세포를 NeuN 음성 집단과 함께 게이트하여 성상세포를 수집한다. NeuN 음성 PAX6 음성 개체군으로부터 관심있는 임의의 추가 신경교 집단을 게이트하고 수집한다. 벌크 단일 핵 RNA 시퀀싱을 위해, 0.04%BSA가 보충된 PBS에서 50, 000 내지 500, 000 핵을 수집한 후, 두 밀리리터의 수크로오스 용액, 50 마이크로리터의 원몰 염화칼슘 및 30 마이크로리터의 원몰 마그네슘 아세테이트를 샘플에 첨가한다.
PBS로 현탁액의 최종 부피를 최대 10 밀리리터까지 가져 오십시오. 튜브 내용물을 역전시켜 혼합하고 15분 동안 얼음 상에서 반응물을 인큐베이션한다. 원심분리에 의해 핵을 펠릿화하고, 핵을 RNA 추출 시약의 한 밀리리터에 재현탁시킨다.
그런 다음 튜브를 와류하고 샘플을 드라이 아이스 위에 동결시키고 핵을 영하 80도에서 저장합니다. 벌크 단일 핵 트랜스포제-허용 크로마틴 시퀀싱을 위해, 50, 000 내지 75, 000 핵을 5%BSA로 코팅된 마이크로원심분리 튜브에서 0.04%BSA가 보충된 PBS로 수집하고, 이들의 하류 분석까지 핵을 동결시킨다. 뉴런, 성상세포, 및 올리고수지상세포 전구 핵 집단은 입증된 바와 같이 신선한 냉동 사후 인간 측두엽 신피질 샘플로부터 분류될 수 있다.
단일 핵 RNA 시퀀싱 연구는 PAX6를 원형질 및 섬유성 성상세포 하위집단 둘 다에 걸쳐 차등적으로 발현된 핵 전사 인자로서 더욱 우선시하였다. 분류 후, 원발성 병리학적 간질 신피질에서의 세포 유형 특이적 전사체 변경이 특성화될 수 있다. 이 분석에서, 전사체 분석은 PAX6 양성 NeuN 음성 집단이 범성세포 마커에 대해 견고하게 풍부해지고 뉴런 마커에 대해 고갈되었음을 확인했다.
면역형광 염색은 인간 피질 성상세포에서 아교세포 세동 산성 단백질과 PAX6의 공동국소화를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 더 짧은 사후 간격은 신선한 조직 샘플로부터의 더 큰 온전한 핵 회복과 관련된다. 무손상 핵의 높은 수율은 사후 24 시간까지 동결 된 조직에서 회복 될 수 있지만, 30 시간에는 손상되지 않은 핵을 거의 회복 할 수 없습니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 PAX6를 발현하는 뉴런이 있기 때문에 NeuN 음성 개체군에서 PAX6 양성 집단을 얻는 것입니다. 이 기술은 또한 간질 외과 적 뇌 표본에서 성상 세포에 대한 연구를 허용하여 특정 병리학 적 틈새 시장의 맥락에서 인간 성상 세포의 분자 조절 장애를 더욱 해명했습니다.
