프로토콜의 전반적인 목표는 살아있는 성인 인간 두뇌 조직에서 1 차적인 microglia 세포를 격리하는 것입니다. 우리의 경우, 이것은 수술 중 수술 창으로 수집되었습니다. 이것은 처음에 얼음 차가운 PBS에 있는 두뇌 조직을 수집해서 달성됩니다, 조직은 그 때 1 mm 큐브 작은 조각으로 다진되고, 난 그냥 트립신 EDTA의 도움으로 했습니다.
이에 따라, 세포는 원심분리에 의해 수확되고 48시간 동안 안드로겐 세포 배양에 적합한 플라스크로 도금된다. 세포는 플라스크에서 다시 한 번 수확되고 추가 사용까지 배양됩니다. 1차 인간 마이크로글리아 세포는 이제 면역 세포 화학을 사용하여 추가 실험을 위해 사용될 수 있다.
성인 인간의 뇌 조직에서 microglia 세포를 격리하기위한 우리의 프로토콜의 주요 장점은 효과적으로 매우 비용 효율적인 방법으로 기본 성인 인간 microglia 세포를 제공한다는 것입니다. 프로토콜은 견고하며 기존 프로토콜에서 사용되는 단계 수를 줄여 셀 손실을 줄입니다. 얼음 차가운 aCSF의 10 mL를 포함하는 50 mL 팔콘 튜브에서 조직을 수집합니다.
수집 튜브를 70% 알코올로 조심스럽게 닦고 무균 라미나르 공기 흐름 챔버로 옮겨보세요. ACSF를 신중하게 폐기하고 팔콘 튜브에서 조직을 계량합니다. 빈 팔콘 튜브의 무게를 추론하여 조직의 약 중량을 계산합니다.
따뜻한 신선한 aCSF에서 섭씨 37도까지. 5 분 동안 따뜻한 aCSF에 조직을 유지합니다. 이 단계는 세포 사멸을 피하기 위해 중요합니다.
aCSF를 신중하게 폐기하십시오. 그리고 1X PBS로 한 번 티슈를 37도까지 따뜻하게 씻어 낸다. 필요에 따라 반복되는 PBS 세척으로 모든 혈액을 씻어 내도록 하십시오.
5 분 동안 따뜻한 PBS에 조직을 배양. PBS의 절반을 신중하게 폐기하십시오. 남은 PBS와 함께 멸균된 페트리 접시에 티슈를 옮길 수 있습니다.
1mL 파이펫으로 남은 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 이것은 조직의 손실을 방지 할 것이다. 멸균 메스를 사용하여 적어도 1mm 큐브 작은 조각으로 발행 주사위.
페트리 접시에 0.25%의 트립신 EDTA 2mL을 넣고 파이펫의 도움으로 접시를 철저히 씻으십시오. 다진 조직을 그램 조직당 10mL를 함유하는 50mL 팔콘 튜브로 0.25%의 트립신 EDTA로 옮김한다. 10mL 세로지오피펫을 통해 파이펫팅하여 섞는다.
37도 섭씨와 250 rpm의 속도로 30 분 동안 셰이커에 튜브를 배양하십시오. 트립신을 중화하기 위해 중간 중화 10mL를 추가합니다. 10mL 세로지오피펫과 철저히 섞으세요.
10 분 동안 섭씨 4도에서 2000G에서 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고 배양 배지의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 안드로겐 세포에 적합한 T25 플라스크에 세포를 놓고 4mL의 추가 배양 배지를 추가한다.
배양 배지는 20%L929 상류제 와 1%연쇄절제술을 함유할 것이다. 주식 문화 배지에 추가하는 대신 플라스크에 L929 상체를 별도로 추가하는 것이 좋습니다. 우리는 균질적으로 조직을 처분하는 플라스크로 완성됩니다.
오염의 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에 흔들리는 동안 플라스크의 목에 미디어를 가져 오지 마십시오. 플라스크를 섭씨 37도에서 48시간 동안 5%CO2로 배양합니다. 원심분리기 튜브에서 0일째에 준비된 T25 문화 플라스크에서 미디어를 수집합니다.
수집된 미디어를 4도 에서 4분 동안 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 수집된 매체가 원심 분리되는 동안, 1X PBS로 1회 0플라스크를 세척하십시오. 플라스크를 부드럽게 흔들어 남은 조직 조각을 제거합니다.
잔재된 조각이 문화에 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 플라스크의 가혹한 흔들림을 피하십시오. 플라스크에 신선한 문화 매체 5mL를 추가합니다. 원심 분리 된 튜브에서 상체를 폐기하십시오.
튜브 중 하나에 배양 매체 1mL을 추가하고 파이펫과 완전히 섞습니다. 연재하여 다른 튜브에 셀이 혼합 된 미디어를 추가하고 완전히 섞습니다. 안드로겐 세포에 적합한 별도의 T25 플라스크에 세포를 놓습니다.
플라스크에 신선한 문화 매체 4mL를 추가합니다. 플라스크를 섭씨 37도에서 48시간 동안 5%CO2로 배양합니다. 플라스크에서 미디어를 폐기하고 신선한 5mL 문화 매체를 추가합니다.
플라스크를 섭씨 37도에서 48시간 동안 5%CO2에서 배양합니다. 6 일째에, 세포는 추가 실험을 위한 준비가 될 것입니다. 여기에 표시된 이미지에서.
섹션의 첫 번째 패널 GFAP로 염색 된 성상 세포, 녹색 색상. 두 번째 패널에서, 섹션 RCA와 마이크로 글리아 얼룩의, 녹색 색상. 섹션 B 마이크로글리아에서 RCA로 염색, 이는 색상에 녹색, 그리고 성상 세포는 GFAP로 염색, 색상에 빨간색.
이미지의 오버레이는 마이크로글리아와 성상세포가 함께 표시됩니다. 준비된 배양에 있는 세포의 대다수가 microglia이다는 것은 심상에서 분명합니다. 이미지는 시각 장애인 제어에 의해 정량화되었고 그 결과는 C.섹션C.에서 표현되는 결과는 제조된 배양에서 세포의 약 80%가 마이크로글리아 세포임을 보여주었다.
이 기술은 약 1 시간 반에서 수행 할 수 있습니다. 이 절차에 따라 나는 다운 스트림 실험에 더 사용할 수있는 성인 인간의 뇌 조직에서 priming microglia를 선택하는 방법의 좋은 이해가 있어야합니다.
