이 프로토콜은 본질적으로 이질성 때문에 일반적으로 까다로운 뮤린 폐 밸브의 구조 기능에 대한 질문에 대답하도록 설계되었기 때문에 중요합니다. 제어 고정 및 상반신 이미징은 여러 길이 저울에서 구조를 캡처하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 로컬 고해상도 이미지를 폐 밸브의 정확한 해부학 적 위치로 다시 매핑 할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 전국 아동병원의 재생의학 센터의 미세수술 책임자 인 타이 이 박사가 될 것입니다. 미세 가위, 마이크로포스, 마이크로포스, 마이크로혈관 클램프, 클램프 적용 집게, 마이크로니들 홀더, 스프링 가위 및 방사관을 포함하여 마우스 해부에 필요한 공구를 자동화하는 것으로 시작합니다. 성인 C57BL/6 마우스를 안락사한 후 트레이에 등쪽 의 자세를 취하고 테이프로 팔다리를 고정하고 토라코토미를 수행합니다.
여분의 지방 조직과 근막을 제거하여 심장을 노출한 다음 오른쪽 아트리움을 제거하고 실온 식염수 용액으로 왼쪽 심실을 견딜 수 있습니다. 우수한 베나 카바, 열등한 베나 카바, 폐 동맥 및 대동맥을 절단하여 심장 전체를 제거하고, 심실 접합부 에서 약 2 밀리미터를 잘라, 이는 가압을위한 도관 역할을합니다. 왼쪽 및 오른쪽 심실을 제거하여 챔버를 대기압에 노출시켜 폐 트렁크 구조가 심실을 제거하여 영향을 받지 않도록 합니다.
폐 동맥과 아나스토모세 가압 튜브, 전단지와 폐 트렁크의 큰 움직임을 수용하기 위해 부비네 관 접합과 튜브의 끝 사이의 약 1 밀리미터 거리를 떠나. 저수지를 유사한 생리적 압력으로 높이고 식염수 용액으로 채웁니다. 흐름 전달 시스템을 테스트하여 막힘이나 기포가 없는지 확인합니다.
스토퍼드 폐 밸브에 스톱콕을 부착하고 유출로를 전환하여 튜브를 통해 적절한 흐름을 보장합니다. 흐름이 충분하면 유출을 해부학된 폐 밸브로 전환하고 트렁크 팽창으로 확인된 폐 트렁크의 가압을 보장합니다. 폐 트렁크의 가압을 확인한 후 식염수 용액의 저수지 용량의 25%가 제거될 때까지 1차 고정 용액을 점진적으로 통합한다.
건조를 방지하기 위해 조직 샘플 위에 고정 담근 거즈를 놓습니다. 고정을 3시간 동안 재충전하여 저수지를 리필하여 일정한 압력을 유지합니다. 관류 후 최대 1주일 동안 사용할 때까지 심장 판막을 섭씨 4도에 고정용액에 보관하십시오.
염색을 위해 고정 심장 밸브 샘플을 차가운 0.15 대구식 버퍼로 5분간 3회 세척하고 1.5칼륨 페로시니드, 0.15 해어 카코디레이트, 2밀리알라 칼슘 염화칼슘, 2%의 오스뮴 테트산화물을 얼음 위에 1시간 동안 용액으로 완전히 침수한다. 샘플을 실온 이중 증류수로 세척하여 약간의 동요로 5 분 동안 튜브에 넣습니다. 세 번 더 세척한 후 실온에서 여과된 티오카르보히드라지드 용액에 샘플을 배치합니다.
20 분 후, 이전에 설명한 대로 물로 샘플을 세 번 씻으라. 다음으로, 실온에서 2% 오스뮴 테트옥사이드에 샘플을 배치합니다. 30분 후, 물로 3회 씩 3분간 세척하고 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 1%의 우라량 아세테이트로 배양합니다.
한편, 납 질산염의 용액을 준비한다. 다음 날, 앞에서 설명한 대로 세정 단계를 3회 수행한 다음, 30분 동안 60°C에서 납 압액을 유도합니다. 샘플을 세 번 더 세척한 다음, 새로 준비된 20, 50, 70 및 90%에탄올을 얼음위에 각각 5분 동안 준비한 심장 판막 조직에 연속 탈수 처리를 한 다음, 100% 에탄올로 두 번 후속 처리됩니다.
탈수 후, 얼음 차가운 아세톤에 조직을 이동한 다음 10 분 동안 실온에서 신선한 아세톤에 놓습니다. 포함의 경우 제조업체의 사양에 따라 수지 혼합물을 만듭니다. 25 ~75, 50 ~ 50 및 75 ~ 25 수지의 후속 치료에 조직을 각각 2 시간 동안 아세톤 혼합물에 놓습니다.
마지막으로, 하룻밤 동안 100 % 수지에 조직을 배치합니다. 다음 날, 신선한 100 % 수지에 조직을 배치합니다. 2 시간 후, 내장 캡슐에 조직을 전송 신선한 100 %의 수지와 치료48 시간 동안 60도 섭씨 오븐에 배치합니다.
수압의 적용 전과 다음의 절제된 마취폐 동맥이 여기에 나타난다. 폐 트렁크는 폐 밸브 전단지가 닫힌 구성에 있음을 나타내는 복사로 비경향이 있습니다. 마이크로컴퓨터 단층 촬영은 폐 밸브 확인을 확인했습니다.
전단지가 닫혔고 무효화는 원형으로 되어 고정 또는 동맥 붕괴에 의한 부적절한 폐 밸브 가압정도가 관찰되었다. 가상 횡단면을 렌더링하는 마이크로 CT 볼륨은 슬라이스 방향과 위치를 확인하기 위해 광학 이미지와 상관 관계가 있었습니다. 고해상도 SBF SEM 이미지는 시편 블록이 원하는 위치와 방향에 있을 때 전단지 내의 로컬 지역에서 촬영되었습니다.
마이크로 CT 볼륨 렌더링 가상 슬라이스, 저해상도 및 고해상도 SBF SEM 이미지 간의 상관 관계는 여기에 표시됩니다. 폐 판막의 분할 된 영역의 3D 표현에서, 내피 세포, valvular 간질 세포 및 세포 외 섬유와 같은 세포 외 구성 요소를 식별 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 가압을 수행하는 것이 중요하며 수율이 가능한 한 높게 유지되도록 하십시오.
