이 방법은 숙주 세포에 박테리아 준수의 신속하고 높은 처리량 검출을 제공합니다. 종래의 도금 방법에 비해, 부착된 박테리아의 정량화에 필요한 실습 시간을 줄입니다. 이 기술은 자동화되고, 시간 절약적이며, 매우 재현할 수 있습니다.
그것은 또한 널리 호스트 셀의 대부분에 둘 다에 적용. 이 방법은 매우 간단합니다. 첫 번째 예심을 위해, 감염의 복합성 같이 조건, 또한 호스트 박테리아 공동 잠복기 시간을 최적화해야 합니다.
먼저 실온에서 2 분 동안 13, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 기하급수적 인 단계에서 세균 배양을 수확하십시오. 1 밀리 리터 PBS로 세포 팔레트를 세척 한 후, 1 밀리 리터 PBS에서 세균 팔레트를 다시 중단. 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하여 세균 현탁액의 농도를 결정합니다.
그런 다음 세균 현탁액을 염색하기 위해 500 배 농축 육수 녹색 또는 빨간색 염색염2개를 세균 현탁액 1 밀리리터에 추가하여 염료를 한 배 희석시 넣습니다. 어둠 속에서 부드러운 회전으로 실온에서 30 분 동안 세포를 배양하십시오. 30 분 후, 2 분 동안 13, 000 배 G에서 스테인드 박테리아를 원심 분리하고 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
2 분 동안 13, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 얼룩진 세균 세포를 수집합니다. 신선한 F12 K 배지의 1 밀리리터로 펠릿을 재연하고 600 나노미터에서 각 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 후속 감염 및 숙주 세포 농도의 복합성에 따라 원하는 농도로 배양을 희석시.
세균 준수 분석의 경우, 이전에 배양 된 A549 세포 모노 층을 각 우물에 100 마이크로 리터를 추가하고 부드럽게 피펫을 위아래로 씻어 세 번 씻으십시오. 그런 다음 PBS를 폐기합니다. 또는 PBS를 추가한 후 10초 동안 기다린 다음 진공을 사용하여 PBS를 제거합니다.
세균성 협회의 운동성을 결정하기 위하여는, 감염의 다른 복합성으로 세균현약의 원하는 농도의 100 마이크로리터로 세포를 오버레이. 박테리아를 스핀 다운 하 고 추가 1 시간 동안 섭씨 37도및 5%이산화탄소에서 감염된 A549 세포를 배양. 입증 된 바와 같이 따뜻한 PBS로 모노 층을 5 번 세척하여 언바운드 박테리아를 제거합니다.
다음으로, 얼음에 96 웰 플레이트의 모든 우물에 4 %의 포름알데히드의 100 마이크로 리터를 추가하여 세포를 수정합니다. 15분 후 PBS로 플레이트를 세 번 세척하여 고정 용액을 제거합니다. 실온에서 10 분 동안 밀리리터 DAPI 얼룩 당 50 나노 그램으로 핵에 얼룩.
PBS로 세포를 세척한 후, 감염된 A549 세포를 PBS 100 마이크로리터로 덮어 건조를 피하고 어두운 에서 최대 2일 동안 4도에 접시를 보관하거나 이미징을 진행하십시오. 데이터 무결성을 유지하기 위해 각 웰의 5개 위치를 임의로 수동으로 선택하여 이미지를 20배 배율로 캡처합니다. GFP 채널, DAPI 의 밑에 박테리아의 형광 심상을 포착하고, 적색 형광염에 의해 염색된 박테리아에 대해 PE Si 5 채널을 사용합니다.
더 나은 해상도를 달성하기 위한 목표에 따라 스무딩 을 위한 롤링 볼의 매개 변수를 설정하고 이미지 디온볼루션의 포인트 스프레드 함수를 자동으로 측정합니다. 숙주 세포 및 박테리아의 형광 강도를 측정합니다. 숙주 세포 및 박테리아의 가장 약한 형광 강도를 세포 수에 대한 임계값으로 설정하고 준수 박테리아로서 15 마이크로미터 거리 내에 있는 숙주 세포에 근접한 모든 박테리아를 계산한다.
세포가 모든 자동화된 심상에서 계산되면 숙주 세포 수, 세포 크기 및 모양, 총 세균 수 및 숙주 세포당 평균 세균 계정과 같은 중요한 판독값을 분석하여 세균 성 준수를 결정하는 가장 중요한 지표입니다. 공동 인큐베이션의 1 시간 후, pseudomonas aeruginosa 균주 PAO1 용량 의존 방식으로 A549 세포에 부착. 유사한 결과는 또한 그람 양성 박테리아 리스테리아 단세포 유전자 및 그것의 부정적인 통제 간균 subtilis 때 관찰되었습니다.
숙주 부착 P aeruginosa 세분화의 대표적인 이미지는이 프로토콜을 사용하여 세균 세포를 계산의 용이성을 보여줍니다. 자동화된 분석의 결과는 세균성 및 숙주 세포 수, 숙주 세포 당 평균 세균 성 수 및 숙주 세포 건강의 상태를 나타내는 영역, 세균성 준수 수준 및 세균 성 세포 독성을 포함한다. A549 세포 외에도 HUVECs는 준수 분석에 대해서도 테스트되었습니다.
세라티아 루비다아와 연쇄상구균 아갈락시아는 HUVEC를 준수했지만 A549 세포는 아니며, 이 방법을 사용하여 숙주 세균 상호 작용을 연구하기 위해 여러 호스트의 효과적인 검출 및 적합성을 입증하였다. 숙주 세포는 우물의 바닥에 바람직하지 않은 박테리아 준수를 최소화하기 위해 약 90 ~ 100 %의 합류에 도달해야합니다. 이 기술은 연구원이 새로운 기계장치, 호스트 해충 상호 작용을 탐구하는 것을 허용할 것입니다.
