우리의 발견은 시뮬레이션 허혈 재증식 손상에 대한 심근 세포 보호에서 내피 세포의 역할을 테스트하기위한 유리한 시험관 내 모델을 제공하기 위해 내피 세포 심근 세포 공동 배양 공간 환경을 최적화하는 것이 필요하다는 것을 시사한다. 세포 공동 배양 모델은 세포 기능 및 분화에 대한 세포-세포 상호작용의 역할을 조사하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 그러나, 세포 유형 간의 분리된 처리와 단일 세포 유형의 하류 분석은 혼합 공동 배양에서 쉽게 실현가능하지 않다.
현재의 연구는 저산소증 재증식 손상을 유발할 수있는 의미있는 거리를 가진 두 개의 분리 된 세포층을 만들고 단일 세포 유형에 대한 결과와 효과를 연구하는 것을 목표로했습니다. 두 세포주를 모두 해동시켜 준비를 시작한다. 세포를 T25 플라스크에 플레이트한 후 신선한 배지로 세척한다.
다음 날에는 배지로 세포를 새로 고치고 합류 할 때 사용하십시오. 세포 배양 배양기를 섭씨 37도에서 21%산소, 5%이산화탄소 및 74%질소로 유지한다. 가습 상태로 유지하십시오.
심근세포 세포주 컨플루언시를 광학 현미경으로 추정한다. 합류성 세포 배양물을 함유하는 플라스크로부터 배지를 제거하고, 플라스크 당 삼내지 오밀리리터의 트립신-EDTA로 트립신화한다. 플라스크를 부드럽게 교반하고 섭씨 37도에서 두 분에서 5 분 동안 배양하십시오.
그 후, 효소 진행을 광학 현미경으로 평가한다. 분리 후, 트립신 또는 세포 용액을 T25 플라스크 당 10 밀리리터의 배지를 함유하는 50 밀리리터 튜브에 첨가하여 트립신 용액을 불활성화시킨다. 세포 현탁액을 120 x g에서 2분 동안 원심분리하여 연질 세포 펠렛을 얻었다.
원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 다섯 밀리리터의 배지에 재현탁시킨다. 다음으로, 세포 계수를 수행하고 세포 생존율을 확인하십시오. 재현탁된 세포 10 마이크로리터와 트리판 블루 염료 10 마이크로리터의 분취량을 혼합한 다음, 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포를 계수한다.
원하는 파종 밀도를 얻기 위해 세포를 신선한 일반 배지로 희석하십시오. 24-웰 플레이트를 세포외 매트릭스로 프리코트하고 플레이트 심근세포를 플레이트 바닥에 웰 당 300, 000의 시딩 밀도로 취하십시오. 하룻밤 사이에 5 % 이산화탄소로 세포를 섭씨 37도에서 유지하십시오.
24시간 후, 플레이트 내피 세포를 인서트 당 100, 000의 최적 도금 밀도로 인서트에 넣는다. 내피 세포 플레이팅의 24시간 후에, 심근세포 웰 내부에 내피 세포 삽입물을 놓고 공동 배양을 개시한다. 실험을 수행하기 전에 세포를 12 내지 24시간 동안 공동배양하도록 허용한다.
50 밀리리터 원뿔형 튜브에 약 25 밀리리터의 매체를 부어 저산소 매체를 준비하십시오. 공기 밀봉은 실리콘 멤브레인으로 상단을 밀봉하고 멸균 된 피펫을 사용하여 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 다른 구멍을 만들고 피펫의 약 2/3을 미디어에 잠깁니다.
배지를 분당 30리터의 유속으로 5분 동안 저산소 가스로 플러시한 다음, 부착된 세포가 포함된 24웰 플레이트 또는 배양 인서트의 배지를 버린다. 웰 당 10 % PBS의 100 마이크로 리터로 매우 부드럽게 씻고 새로 준비된 저산소 배지 500 마이크로 리터를 플레이트 또는 인서트의 각 웰에 추가하십시오. 원래의 배지를 노목산 대조군에서 포도당과 혈청을 함유하는 신선한 정상 배지로 대체하십시오.
멸균 된 물로 채워진 페트리 접시를 저산소증 챔버에 넣어 챔버를 가습하십시오. 그런 다음 저산소 그룹을 포함하는 플레이트를 챔버에 넣으십시오. 저산소증 챔버를 저산소 가스로 분당 30 리터의 흐름으로 5 분 동안 플러시하십시오.
그 후, 챔버를 섭씨 37도의 인큐베이터 안에 24 시간 동안 두십시오. 저산소증 후, 플레이트 또는 인서트의 오래된 배지를 버리고 포도당과 혈청이 포함 된 정상 배지 500 마이크로 리터를 플레이트의 각 벽에 첨가 한 다음 플레이트를 재관류를 모방하기 위해 두 시간 동안 정상 배양 조건 하에서 배양기 내부에 보관하십시오. 세포 배양 배지를 24-웰 플레이트에서 96-웰 플레이트로 옮긴 다음, 24-웰 플레이트의 각 웰에서 200 마이크로리터의 배지를 취하여 96-웰 플레이트의 네 웰에 균등하게 분배한다.
96-웰 플레이트의 세포독성 분석 키트를 사용하여 LDH에 대한 흡광도를 측정하고 제조업체의 지침에 따라 세포 손상 정도를 확인합니다. 이 연구에서는 세 가지 유형의 삽입물을 평가했습니다. 세 인서트 모두 0.4 마이크로미터의 동일한 기공 크기를 가졌다.
그들 사이의 유일한 차이점은 두 개의 공동 배양 된 세포층 사이의 거리가 0.5, 1.0 및 2.0 밀리미터가되도록 허용했다. 이 프로토콜을 사용하여, 세포를 정상 산소 조건 하에서 배양한 다음, 노목성 대조군과 저산소증 그룹의 두 그룹으로 나눴다. 24시간 후, 두 그룹 모두 배지로 상쾌하고 종점 분석을 수행하기 전에 또 다른 두 시간 동안 정상 산소 조건하에서 배양하였다.
심근세포 단독, 내피 세포 단독, 심근세포와 내피 세포의 공동 배양에 대한 젖산 탈수소효소 방출을 평가하는 세 가지 유형의 배양 삽입물의 비교는 노르녹시, 저산소증만, 저산소증 재산소화 조건 하에서 여기에 제시된다. 세포층 사이의 0.5 밀리미터 거리에서, 저산소증은 심근 세포가 단독으로 배양되었을 때 노르 목시아에 비해 LDH 방출을 유의하게 증가시켰다. 그러나, LDH는 저산소증 전용 그룹에 비해 저산소화 그룹에서 단지 약간 증가하였다.
내피 세포와 심근 세포가 함께 공동 배양되었을 때, 저산소증 전용 조건 하에서의 LDH 방출의 증가는 감쇠되지 않았다. 이는 내피 세포가 저산소증 전용 조건하에서 심근세포 단독군에 비해 어떠한 보호 효과도 갖지 않았음을 나타낸다. 그러나, 내피 세포는 HR 동안 심근세포에 경미하지만 유의한 보호를 발휘했다. 세포층 사이의 거리가 한 밀리미터였을 때, LDH 방출은 또한 저산소증 전용 조건 하에서만 심근세포에서 유의하게 증가하였다.
그러나, 0.5 밀리미터 삽입물에서와 달리, 심근세포의 LDH 증가는 저산소증 전용 조건에 걸쳐 HR에 의해서만 강화되었다. 이 증가는 두 밀리미터 인서트로 더욱 두드러졌습니다. 2밀리미터 인서트에 플레이팅된 내피 세포의 농도를 인서트 당 각각 25, 000, 50, 000 및 100, 000 세포로 적정하였다.
공동 배양물에서 내피 세포 강도의 증가가 HR에 의한 LDH 방출의 용량 의존적 감쇠를 유도한다는 것이 발견되었다. 그러나 규범 적 조건 하에서는 그러한 효과가 나타나지 않았습니다. 이러한 공동-배양 방법론은 내피 세포 및 심근세포에 한정되지 않는다. 이러한 방법은 관심의 여러 기관에 걸쳐 다양한 세포주 사이의 특정 세포 - 세포 상호 작용의 조사를 원조해야한다.
