아미노산 흡수와 대사는 조골 세포 사양, 분화 및 뼈 형성에 필수적입니다. 이 프로토콜은 아미노산 흡수를 평가하기 위한 신속하고 민감한 방법을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 방사성 표지 된 아미노산을 사용하여 아미노산 섭취를 정량화합니다.
다양한 조건에 맞게 쉽게 수정할 수 있는 저렴하고 민감하며 빠른 방법입니다. 이 프로토콜은 일차 또는 형질 전환 세포뿐만 아니라 다양한 조직에서 포도당 및 지방산과 같은 다른 방사성 표지 영양소의 흡수를 평가하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 5회 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에서 ST2 세포를 10회 10회 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 알파 MEM 배지에서 시작한다.
정규화를 위한 조건당 세포 수를 정량화하기 위해 세포의 여분의 웰을 플레이트합니다. 다음으로, 합류할 때까지 섭씨 37도의 가습 세포 배양 인큐베이터에서 5%이산화탄소와 함께 2-3일 동안 세포를 배양합니다. 배양 후 배지를 흡인하고 세포를 pH 7.4에서 1 밀리리터의 PBS로 2 회 세척한다.
그런 다음 1 밀리리터 Krebs-Ringer 's hepes 또는 KRH로 세포를 한 번 세척하기 전에 PBS를 흡인하십시오. L34 트리티에이티드 글루타민 작업 배지 밀리리터당 4개의 마이크로큐리를 함유한 신선하게 준비된 KRH 0.5밀리리터로 세포를 5분 동안 배양합니다. 배양 후 방사성 배지를 수집하여 액체 폐기물 용기에 분배합니다.
그 후 세포를 얼음처럼 차가운 KRH로 3회 세척하여 반응을 종결시켰다. 다음으로, 각 웰에 1 % 나트륨 도데 실 설페이트 1 밀리리터를 첨가하고 혼합물을 10 회 분쇄하여 세포를 용해시키고 균질화한다. 그런 다음 세포 용해물을 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 최소 10, 000 G의 속도로 10 분 동안 원심 분리하여 용해물을 정화합니다.
상청액을 8 밀리리터의 섬광 용액이 들어있는 섬광 바이알로 옮기고 섬광 계수기를 사용하여 분당 전파 활동 및 카운트를 읽습니다. 세포의 나머지 비방사성 플레이트에서 세포를 트립신화, 재현탁 및 계수하여 용해된 방사성 배양물에서 세포 수를 추정합니다. 혈구계를 사용하여 각 실험 조건에 대해 비방사성 웰당 세포 수를 계산합니다.
아미노산 섭취를 확인하려면 뼈 샤프트의 무게를 측정하기 전에 뼈에서 골수를 씻어냅니다. 뼈를 탈세포화하려면 PBS에서 상완골 하나를 섭씨 100도에서 10분 동안 끓입니다. 섭씨 37 도의 세포 배양 인큐베이터에서 30 분 동안 KRH 1 밀리리터의 살아있는 부식질과 삶은 상완골을 평형화시킵니다.
다음으로, 실험 및 끓인 대조군 뼈를 밀리리터 L234 트리시에이티드 아르기닌 당 4개의 마이크로카레를 함유하는 새로 준비된 KRH에서 섭씨 37도에서 최대 90분 동안 별도로 배양한다. 방사성 매질을 제거한 후, 상완골을 얼음 차가운 KRH 1 밀리리터로 3회 세척하여 반응을 종결한다. 각 뼈를 1.5 마이크로 리터의 RIPA 버퍼가있는 500 밀리리터 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 가위로 100 번 절단하여 상완골과 RIPA 버퍼를 균질화 한 다음 35 % 진폭에서 초음파 처리하고 10 초 동안 1 초 펄스를 처리합니다. 용해물을 실온에서 10, 000번 G에서 10분간 원심분리하여 명확히 하였다. 원심분리 후, 200 마이크로리터의 상청액을 8 밀리리터의 섬광 용액을 함유하는 섬광 바이알에 옮긴다.
섬광 카운터를 사용하여 라디오 활동을 읽습니다. 시험관내 L34 삼중화 글루타민 흡수 및 합류성 ST2 세포의 동역학적 특성은 나트륨 메틸아미노이소부티르산 또는 리튬의 존재 또는 부재하에서 평가하였다. 나트륨 제거로 글루타민 섭취가 90 % 감소했습니다.
리튬의 존재는 나트륨이없는 상태에 비해 글루타민 흡수를 2 % 증가 시켰습니다. 반면 메틸 아미노 이소 부티르산은 글루타민 흡수에 영향을 미치지 않았습니다. 시스템 A, N, L 또는 ASC 및 감마 플러스 L의 추정 백분율 기여도는 대부분의 글루타민 흡수가 시스템 ASC에 의해 매개되고 감마와 L.시스템 N이 약 2 %의 나트륨 의존성 글루타민 섭취를 담당한다는 것을 나타냅니다.
그리고 시스템 A는 0%의 기여도와 흡수를 보였습니다. X-VIVO L34 삼발화성 아르기닌 흡수를 삶은 신생아 상완골에서 2시간의 시간 과정에 걸쳐 분석하였다. 아르기닌 흡수는 실험 전반에 걸쳐 선형적으로 증가했으며 상완골이 살아 있습니다.
끓인 상완골은 실험에서 아르기닌 흡수의 동적 증가를 나타내지 않았다. 대표적인 분석은 정규화되고 보정 된 아르기닌 흡수를 보여줍니다. 반대쪽 뼈를 능동적 인 대조군으로 끓이는 것이 중요합니다.
이 단계는 뼈 매트릭스가 방사성 아미노산을 흡수하여 부정확한 결과를 초래할 수 있으므로 필수적입니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 시험관 내 및 생체 내 모두에서 아미노산 흡수 역학을 확인할 수있었습니다.
