이 방법은 중족골 배양 프로토콜을 더 큰 뼈에 적용하여 직접 뼈 조작을 복잡한 유전 모델과 결합하여 뼈 발달과 관련된 프로세스를 해결할 수 있도록 합니다. 이 기술은 살아있는 화상 진찰 또는 직접적인 물리적 및 약리학 조작과 같은 생체 내에서 가능하지 않은 뼈 성장의 조작 그리고 분석을 허용합니다. 이러한 전 생체 배양 방법은 치료가 유기체에 미치는 전신 효과로부터 분리되는 뼈내의 유전적 발병의 국소 적 효과에 대한 구체적인 연구를 가능하게 한다.
임신 임신 일 의 복부 영역을 살균하여 시작 14.5 받는 사람의 복부 영역을 살균하여 80%에탄올로 마우스와 작은 가위를 사용하여 피부와 복부 근육을 열어 자궁 뿔에 접근한다. 복강에서 자궁을 추출하려면 심술통을 제거하고 뿔의 기초를 자른다. 그런 다음, 얼음에 얼음 차가운 해부 매체를 포함하는 60mm 페트리 접시에 자궁을 전송합니다.
생물 안전 캐비닛에서 개별 태아를 분리하기 위해 가위를 가진 자루 사이에 잘라내고, 해부 스테레오 현미경의 밑에 신선한 해부 매체와 새로운 60 밀리미터 접시로 개별 자루를 전송합니다. 핀셋을 사용하여 태아를 태반에서 분리하고 태아를 막에서 청소하십시오. 잘린 플라스틱 파이펫을 사용하여 몸을 새로운 60mm 접시로 옮기고 배아를 더 해부하기 전에 참수하십시오.
그런 다음 핀셋을 사용하여 피부를 제거하고 뒤쪽에서 시작하여 발가락으로 벗겨냅니다. 핀셋을 사용하여 척추에 가깝게 자르고 뒷다리를 몸과 분리하십시오. 뒷다리를 얼음-차가운 해부 매체를 함유한 깨끗한 접시로 옮기고, 해골 대퇴골의 표면 연골과 근위 경골 사이에 핀셋을 삽입하여 대초원으로부터 경골을 분리한다.
근위 대퇴골과 칼카뉴뼈와 비골에서 엉덩이 뼈를 제거합니다. 조심스럽게 대퇴골과 티바이어스에서 연조직을 잡아당기고 멸균 된 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 4 개의 다리 뼈를 신선한 해부 매체를 포함하는 24 웰 플레이트의 첫 번째 우물로 옮깁니다. 뼈의 맥박을 연결하는 연조직이 제거된다는 것을 보여주는 것이 중요합니다.
그렇지 않으면 뼈가 구부러지고 적절한 성장을 이루지 못할 것입니다. 뼈가 적절한 실험적 태아 수에서 해부되었을 때, 양상 현미경하에서 각 우물의 뼈를 좋은 대조로 상시 0시에 이미지화하고 각 우물의 해부 배지를 잘 사용하여 뼈를 흡인하지 않도록 각 웰에 배양 배지를 교체합니다. 배양 조건에서 의 성장 억제효과를 관찰하기 위해, 좌측 티비아를 500나노몰라 레티노산으로 처리하고, 제어로서 차량의 동등한 부피로 오른쪽 티비아를 배양한다.
이어서, 표준 세포 배양 조건 하에서 세포 배양 배양에 플레이트를 배치한다. 이틀 후, 뼈를 1~2시간 동안 적절한 티미딘 아날로그로 치료하여 뼈를 10분 동안 4%파라포름알데히드의 개별 2밀리리터 튜브로 옮기기 전에 뼈 세포 증식을 평가한다. 그런 다음, 뼈를 PBS로 전송하여 최종 시점에서 뼈를 이미지한 다음 샘플을 파라포름알데히드로 돌려 보내 섭씨 4도에서 하룻밤 고정합니다.
뼈의 길이 및 광물화된 영역을 측정하기 위해 적절한 이미징 소프트웨어 프로그램을 열고 이미지의 규모를 고려하여 뼈의 총 길이와 광물화된 영역을 모두 측정합니다. 한쪽 끝에 있는 첫 번째 어두운 세포에서 다른 쪽 끝에 있는 마지막 어두운 세포까지 측정을 시작합니다. 하루 평균 길이 증가로 정의된 성장률을 계산하려면 뼈의 최종 길이와 초기 길이 사이의 차이를 배양일 수로 나눈다.
여기서, 배양된 경골과 동등한 단계에서 새로 추출된 경골 의 비교가 나타난다. 최대 2일간의 배양 후, 달성된 크기는 연골과 미네랄화된 뼈 모두에 대한 생체 내 뼈 성장과 비슷합니다. 긴 배양 기간은 배양 된 뼈와 갓 추출 한 뼈 사이의 더 큰 차이로 이어질.
참고, 연조직의 불완전한 제거로 재배된 경골은 배양된 경골의 구부러질 수 있다. 망미산으로 치료하는 것은 치료 2 일 후에 일찍 경골 성장에 강력한 영향을 미칩니다. 문화권에서 이틀 후 경골의 총 길이가 지속적으로 증가하지만, 이 성장은 초기 길이에서 9 ~29 %의 대략적인 증가에 해당합니다.
생체 내에서 관찰 될 뼈 성장 증가 보다 적습니다. 실제로, 티미딘 아날로그 라벨링은 동등한 단계의 갓 추출된 뼈에 비해 배양 후 이 지역에서 더 적은 양성 세포를 나타낸다. 또한, 체외 배양 경골에서, 골격 원소의 총 길이가 실질적으로 증가하지만 광물화된 부위의 증가는 거의 관찰되지 않는다.
조직학적 및 분자 분석 외에도, 배양된 뼈에 적용되는 치료의 세포 효과를 특성화하기 위해 배양 후 클리어링 및 3D 이미징을 수행할 수 있다. 이 기술을 통해 우리는 간 간 통신과 관련된 질문을 해결할 수 있습니다. 예를 들면, 고통 없는 parabiosis 실험의 어떤 종류에 있는 다른 유전 모형에서 뼈를 공동 배양하하.
