이 수직은 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼을 기능적 막횡단 수용체와 조립하는 데 중요한 단계를 제시합니다. 이들 컬럼은 복합 추출물에 존재하는 소분자의 동정과 고정화된 막횡단 수용체와 상호작용하는데 사용될 수 있다. 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼은 복합 혼합물에 존재하는 생물학적 활성 화합물의 동정을 가속화합니다.
세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼의 사용은 식물, 진균, 또는 박테리아 추출물과 같은 복합 천연 매트릭스에 존재하는 약리학적 활성 화합물의 확인에 관심이 있는 사람들에게 특히 흥미로울 수 있다. 시작하려면 120 밀리리터의 벤자미딘을 초순수 탈이온수에 용해시켜 200 밀리몰 벤즈아미딘 원액을 준비하십시오. 흄 후드에 10 밀리리터의 에탄올에 0.017 그램의 PMSF를 용해시켜 10 밀리몰 PMSF 원액을 준비한다.
시판되는 프로테아제 억제제 혼합물을 초순수 탈이온수 1밀리리터에 용해시켜 100X 프로테아제 억제제 칵테일을 준비한다. 칵테일 200 ~ 300 마이크로 리터를 완전히 섞어서 분취하십시오. 이온화 된 초순수 1 밀리리터에 55.114 밀리그램의 ATP 이나트륨 염 수화물을 용해시켜 100 밀리몰 ATP 원액을 준비하십시오.
혼합물의 분취량 100 마이크로 리터를 철저히 혼합하십시오. 3.03 그램의 Tris-HCL, 2.9 그램의 염화나트륨, 0.22 그램의 무수 염화칼슘, 0.2 그램의 염화마그네슘 육수화물 및 0.19 그램의 염화칼륨을 500 밀리리터의 초순수 탈이온수에 용해시켜 완충액을 준비한다. 17.3 밀리리터의 트리스 버퍼와 0.3 밀리리터의 벤자미딘 원액, 0.2 밀리리터의 PMSF 원액, 0.2 밀리리터의 프로테아제 억제제 칵테일, 20 마이크로리터의 ATP 원액, 2 밀리리터의 글리세롤 및 0.029 그램의 EDTA를 혼합하여 균질화 완충액을 준비한다.
염산 용액을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다. 4°C에서 수확한 세포를 섭씨 400 x g에서 5분 동안 스핀다운하고, 상층액을 제거하고, 나머지 세포 펠릿을 1X pH 7.4 빙냉 PBS의 10 밀리리터로 세척하였다. 상청액을 버리고 20 밀리리터의 균질화 버퍼를 첨가하십시오.
원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포 현탁액을 40 밀리리터 Dounce 균질기 조직 분쇄기로 옮기고, 40 개의 상하 페슬 스트로크를 사용하여 얼음 위에서 수동으로 현탁액을 균질화하십시오. 균질화 된 세포 현탁액을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 펠렛을 버리고 상청액을 새로운 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
세포막 펠릿을 저장하고 상층액을 버리십시오. 완충액 8.7 밀리리터와 0.1 밀리리터의 PMSF 원액, 0.15 밀리리터의 벤자미딘 원액, 0.1 밀리리터의 프로테아제 억제제 칵테일, 10 마이크로리터의 ATP 원액, 1 밀리리터의 글리세롤 및 0.2 그램의 나트륨 콜레이트를 혼합하여 가용화 완충액을 준비한다. 가용화 완충액을 세포막 단편과 함께 원뿔형 튜브 내로 옮긴다.
펠렛을 재현탁시킨다. 생성 된 혼합물을 섭씨 네 도에서 150RPM에서 18 시간 동안 회전시킵니다. 18시간 후, 가용화 혼합물을 섭씨 4도에서 47, 900 x g에서 30분 동안 원심분리한다.
100 밀리그램의 IAM을 추가하십시오. 개인용 컴퓨터. DD2 입자는 상청액으로 하여금 생성된 현탁액 혼합물을 섭씨 네 도에서 150 RPM에서 한 시간 동안 회전시킨다. Tris-HCl 24 그램, 염화나트륨 23.4 그램, 염화칼슘 0.06 그램, EDTA 5.85 그램 및 PMSF 0.07 그램을 첨가하여 4 리터의 초순수 탈이온수에 투석 완충액을 준비하십시오.
PMSF를 먼저 소량의 에탄올에 녹인 다음 버퍼를 사용하여 비이커에 천천히 첨가하십시오. 셀룰로오스 막 투석 튜브를 10 센티미터 절단하여 투석 튜브를 제조하고, IAM을 함유하는 현탁액을 옮긴다. 개인용 컴퓨터. DD2 입자 및 세포막 단편은 투석 튜브 내로 들어간다.
투석 튜브 클립으로 투석 튜브의 양쪽 끝을 닫습니다. 투석 튜브를 투석 버퍼에 넣으십시오. 24시간 후, 투석 튜브를 갓 준비된 투석 완충액에 넣고 또 다른 24시간 동안 투석을 계속하였다.
IAM을 세척하는 데 사용될 10 밀리몰 pH 7.4 암모늄 아세테이트 완충액을 준비한다. 개인용 컴퓨터. DD2 입자 및 컬럼 특성화 실험에서 0.778 그램의 아세트산암모늄을 초순수 탈이온수 한 리터에 용해시켰다. 투석 48 시간 후, 투석 버퍼에서 투석 튜브를 제거하고 투석 튜브의 내용을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
상청액을 버리고 나머지 펠렛을 10 밀리리터의 암모늄 아세테이트 완충액으로 세 번 세척한다. 세 번째 세척 후, 나머지 펠렛을 한 밀리리터의 암모늄 아세테이트 완충액에 재현탁시킨다. 이를 완전히 혼합하고 생성된 슬러리를 사용하여 5 x 20 유리 컬럼을 패킹하여 CMAC 크로마토그래피 컬럼을 수득하였다.
컬럼을 포장하려면 이전에 아세트산암모늄 버퍼에 담근 바닥 필터를 필터 홀더에 넣으십시오. 필터 홀더를 유리 컬럼에 끼우고 컬럼 캡을 조여 홀더의 위치를 고정시킵니다. 컬럼을 손가락 클램프에 수직으로 놓고 실험실 스탠드에 고정시킵니다.
기둥 아래에 비커를 놓고 작은 부피의 슬러리를 유리 기둥 벽에 피펫 팁을 고정하는 단일 채널 피펫터로 천천히 유리 기둥으로 옮깁니다. 포장 공정의 속도를 높이려면 각 단계 사이에 마이크로 피펫으로 고정식 침대 위에서 버퍼를 제거하십시오. 상단 필터를 놓고 어댑터 장치를 조여서 고정상 위에 남은 버퍼가 없도록 합니다.
어댑터 잠금 장치로 어댑터 장치의 위치를 고정합니다. 컬럼을 고성능 액체 크로마토그래피 펌프에 연결하고, 암모늄 아세테이트 완충액으로 컬럼을 밤새 세척하고, 유량을 분당 0.2 밀리리터로 설정한다. 더 오래 보관하려면 아세트산암모늄 버퍼에 0.05%나트륨 아지드 용액으로 컬럼을 가동하고, 아지드 나트륨으로 작업할 때 실험실 코트, 안전 안경 및 장갑을 착용하고 섭씨 네 도에 보관하십시오.IAM.
개인용 컴퓨터. DD2 입자는 고정화된 신경모세포종 TrkB 세포막 단편 및 BDNF의 존재하에 형광 입자를 초래하였다. TrkB 세포막이 캡슐화된 IAM 입자 또는 TrkB 세포막 캡슐화된 IAM 입자에서와 같이 BDNF가 사용되지 않았을 때 형광이 관찰되지 않았다. 기능성 CMAC 컬럼은 고정화된 TrkB 수용체에 대해 7, 8-DHF 농도 증가의 전형적인 전두엽 친화성 크로마토그램을 나타내었으며, 이는 보유 시간에 농도 의존적인 변화를 나타냈다.
비기능성 CMAC 컬럼은 마커 리간드의 보유에서 농도 의존적 변화의 결여를 나타내었다. CMAC 음성 대조군 컬럼은 비특이적 상호작용을 배제하기 위해 표적화된 단백질을 발현하지 않는 세포막 단편을 고정화함으로써 제조되었다. 0.2%수성 고투콜라 추출물의 첨가는 작용제 결합 부위에 대한 경쟁 리간드의 존재를 나타내는 7, 8-DHF 보유의 현저한 감소를 가져왔다.
CMAC 음성 TrkBnull 컬럼 상의 7, 8-DHF 체류의 감소의 결여는 이 컬럼 상의 기능적 TrkB 수용체의 결여를 추가로 확인하였다. 누락된 피크 크로마토그래피 접근법은 TrkB 컬럼 상에 강하게 보유된 화합물을 확인하였고, 한편 TrkB 널 컬럼 상에서 초기에 용출되어 특정 상호작용을 나타낸다. 빠른 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼에 대한 수용체의 공급원을 아는 것이 중요합니다.
균질화 및 가용화 완충제를 적절하게 설계하기 위해 문헌을 확인하십시오. 이 프로토콜에서 제조된 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼은 새로운 잠재적 약물 히트를 확인하고 고정화된 수용체와 그의 천연 리간드 사이의 상호작용의 성질을 특성화하기 위해 사용되었다.
