재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

찔린 상처는 비특이적 세포 절제를 유도하는 기계적 손상 방법입니다. 이 방법은 뇌 손상 후 RGC 증식 및 분화의 평가를 용이하게 합니다. 바늘 매개 찔린 상처 손상은 뇌 손상을 유도하는 간단하고 효율적으로 구현된 방법입니다.

이 방법은 표준 도구 세트를 사용하여 많은 실험 샘플에 적용 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 재생 능력은 찔린 상처 부상 모델을 사용하여 설명되었습니다. 신경 재생을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력은 중추 신경계의 재생 치료에 기여합니다.

마취 된 성인 제브라 피쉬 또는 메다카를 스티로폼 트레이에 올려 놓는 것으로 시작하십시오. 스티로폼에 수직으로 삽입된 두 개의 30게이지 바늘 사이에 물고기를 똑바로 고정합니다. 물고기 머리가 움직이지 않도록 물고기 몸을 잡고 두개골을 통해 30 게이지 바늘을 시신경 구조 구체 중 하나의 내측 영역에 수직으로 삽입합니다.

다음으로, 부상당한 물고기를 신선한 생선 시설 물이 담긴 어항으로 옮깁니다. 물고기가 마취에서 완전히 회복되면 탱크를 번식 시스템으로 옮깁니다. 스티로폼 트레이에 종이 타월을 올려 마취 된 생선을 놓습니다.

그런 다음 항문 지느러미의 양쪽에 두 개의 30게이지 바늘을 수직으로 삽입하여 물고기 몸을 제자리에 고정합니다. 물고기가 배치되면 항문에서 심장까지 복부 절개를하십시오. 양쪽에 두 개의 30 게이지 바늘을 삽입하여 심장이 보이도록 합니다.

그런 다음 집게의 끝을 사용하여은 상피층을 제거하십시오. 30게이지 바늘을 심실에 삽입하고 경사를 위로 유지하고 집게를 사용하여 심방을 절개합니다. 그런 다음 주사기를 눌러 심방에서 혈액을 씻어내어 PBS를 심방으로 밀어 넣습니다.

혈액이 배출되고 아가미가 하얗게 변하면 PBS 관류를 중단하십시오. 나중에 물고기 몸을 제자리에 고정하는 바늘을 제거하고 물고기 복부 쪽을 아래로 고정합니다. 척수를 절단하고 시신경과 종뇌에서 두개골을 제거한 후 시신경을 절단하고 뇌를 해부합니다.

다음으로, 뇌를 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터가 함유 된 1.5 밀리리터 튜브에 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 고정시킵니다. 고정된 뇌를 PBS에서 각각 5분씩 3회 세척한 후 동결방지제로 PBS에 30중량% 자당 1밀리리터를 넣고 1.5밀리리터 튜브에 뇌를 옮기고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 30% 자당과 30밀리리터의 최적 절단 온도 또는 OCT 화합물을 결합하여 임베딩 화합물을 준비하고 섭씨 4도에서 화합물을 보관합니다.

cryomold를 한 번 식히려면 섭씨 영하 80도에서 밤새 알루미늄 블록을 배양하고 예냉 된 블록을 뚜껑이 달린 스티로폼 상자에 넣어 따뜻하게합니다. 관상 절편의 경우 현미경으로 집게를 사용하여 방향을 조정하여 해부된 뇌를 극저온 몰드에 삽입합니다. 다음, 스티로폼 상자의 사전 냉각된 알루미늄 블록에 cryomold를 놓고 OCT 화합물이 얼어 흰색이 되도록 합니다.

화합물이 얼면 검체 디스크에 극저온 블록을 장착하기 전에 검체 디스크에 작은 원형의 OCT 화합물을 도포합니다. 표본 디스크를 저온 유지 장치에 넣어 OCT 화합물을 동결합니다. 그런 다음 저온 유지 장치의 표본 헤드에 표본 디스크를 놓습니다.

크라이오 블록의 방향을 설정한 후 OCT를 트리밍하여 추가 영역을 제거합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 전체 시신경을 통해 14마이크로미터 두께의 직렬 섹션을 절단하고 슬라이드를 섭씨 영하 25도에서 보관합니다. 제브라피쉬의 뇌 조직에서 방사형 신경교 세포(RGC) 증식을 평가했습니다.

대부분의 RGC는 손상되지 않은 반대쪽 반구에서 음성 세포 항원을 증식시켰습니다. 부상 후 이틀 후, RGC 증식이 medaka tectum의 손상된 쪽에서 유도되었습니다. 뇌 손상 후, 세포 계통 및 RGC 분화는 브로모데옥시유리딘 또는 BrdU 표지로 평가되었습니다.

대표적인 분석은 손상된 제브라피쉬와 메다카에서 손상 후 7일째에 신생아 뉴런을 보여줍니다. 찔린 상처 부상의 중요한 단계 중 하나는 수동 바늘 삽입입니다. 재현 가능한 결과를 만들기 위해서는 일관된 부상이 필요합니다.

형광 염료는 상처 마커로 효과적입니다. 형광 염료 확산 정도는 찔린 상처의 위치와 깊이를 나타냅니다. 이 기술은 잠재적으로 다른 작은 어종에 적용될 수 있으며, 메다카에 적응하면 재생 능력을 비교할 수 있습니다.