이러한 상세한 프로토콜은 다른 MMP 치료 표적에 적용될 수 있는 E.Coli에서 재조합 MMP-3 촉매 도메인에 대한 박테리아 발현의 매우 효율적이고 비용 효율적인 방법을 기술한다. E.coli에는 복잡한 단백질 폴딩 및 번역 후 처리 시스템이 부족합니다. 이 방법은 E.coli에서 진핵 단백질 발현을 향상시키기 위해 R2DP 세포 균주를 사용한다.
특정 MMP의 과잉 생산은 암, 심장 혈관 및 신경 퇴행성 질환과 같은 여러 질병을 유발합니다. 활성 가용성 MMPs는 MMP 억제 치료제의 개발을 위해 필요하다. LB 암피실린 클로람페니콜 내성 플레이트로부터의 pET His-tag 프로MMP-3 촉매 도메인 형질전환체의 단일 단리된 콜로니를 섭씨 37도에서 LB 암피실린 클로람페니콜 내성 매질의 5밀리리터에 접종한다.
각 배양물에서 분취량을 저장하고 40 % 글리세롤 주식을 준비하십시오. 밤새 배양한 LB 암피실린 클로람페니콜 내성 배지 500 밀리리터를 함유하는 1리터 플라스크에 600 나노미터에서 0.05 내지 0.1의 광학 밀도로 접종한다. 여러 시점에서 600 나노 미터의 광학 밀도를 측정하십시오 (일반적으로 0.4와 0.6 사이가 될 때까지 3 ~ 4 시간 동안).
하나의 몰 IPTG 스톡으로 배양물을 하나의 밀리몰의 최종 농도로 유도하였다. 추가로 37도 진탕기에서 추가로 서너 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 섭씨 13, 000 G 및 4도에서 250 밀리리터 원뿔형 병에서 10분 동안 원심분리하고, 배양물이 완전히 펠릿화될 때까지 반복한다.
펠릿 그램 당 세 밀리리터의 용해 버퍼를 추가하고 볼텍스 또는 피펫팅으로 펠렛을 재현탁하십시오. 배양 1 리터 당 10 부피 % 중량의 1.25 밀리리터의 데옥시콜레이트 나트륨을 첨가하십시오. 배양 1 리터 당 10 마이크로 리터의 DNase I을 첨가하십시오.
실온에서 150 RPM으로 30분 동안 진탕한다. 섭씨 13, 000 G 및 네 도에서 10분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.
펠렛을 봉입체 버퍼의 리터 당 100 밀리리터의 배양물에 재현탁하여 위아래로 피펫팅합니다. 과열을 방지하기 위해 초음파 처리 중에 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 각 샘플을 15초의 여섯 사이클, 5개의 출력과 50%펄스 동안 초음파 처리하십시오.
샘플을 섭씨 13, 000 G 및 네 도에서 10분 동안 원심분리한다. 펠릿을 확인하십시오. 펠렛이 컴팩트하면 상층액을 버리십시오.
한 리터 배양물과 다섯 밀리리터의 가용화 완충액으로부터 각 펠렛을 재현탁시킨다. 단백질이 가용화될 수 있도록 얼음 위에서 적어도 30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 섭씨 4도에서 13, 000배 G에서 10분 동안 원심분리한다.
원심분리 후 펠렛이 형성되면 상층액을 별도의 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 붓습니다. 펠렛을 위아래로 피펫팅하여 배양 한 리터당 다른 다섯 밀리리터의 가용화 완충액에 재현탁시킨다. 섭씨 13, 000 G 및 네 도에서 10분 동안 원심분리한다.
다음으로, 상청액을 당깁니다. 펠릿을 버리거나 추가 초음파 처리를 위해 영하 80도에 보관하십시오. HT 세척 완충액에 대해 블랭크하고, 첫 번째 세척 분획의 A280을 기록한다.
A280이 기준선에 가까워질 때까지 다른 분수와 함께 반복합니다. 즉시 HT 용출 완충액 다섯 밀리리터를 추가하여 His-tagged 단백질을 용출시킵니다. HT 용출로 표지된 마이크로퍼지 튜브에서 0.5 내지 하나의 밀리리터 분획에서 유동을 수집한다.
용출 분획의 A280을 측정한다. A280이 밀리리터 당 0.3 밀리그램보다 큰 경우, HT 평형 완충액으로 분획을 희석하십시오. 용출된 MMP 분획을 투석 튜브 중 한 리터의 투석 완충액에 잠기고 튜브 및 그의 내용물을 네 °C에서 적어도 여덟 시간 동안 자기 교반 하에 교반한다.
투석 완충액 두 리터 한 리터로 옮기고 튜브와 그 내용물을 섭씨 네 도에서 적어도 여덟 시간 동안 자석 교반으로 저어줍니다. 다음으로, 투석 버퍼 세 리터 한 리터로 옮기고 튜브와 그 내용물을 섭씨 네 도에서 여덟 시간 이상 자석 교반 위에 저어줍니다. 샘플을 적절한 용기로 옮기고 다이얼링된 MMP로 라벨을 붙인다.
튜브에 침전물이 있는지 검사하십시오. 밀리리터 MMP 당 한 밀리그램의 밀리리터 분취량 당 20 밀리몰 APMA의 50 마이크로리터를 추가하여 한 밀리몰의 최종 APMA 농도에 도달합니다. 침전물이 형성되면, 섭씨 네 도에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리한다.
상청액을 활성화된 MMP로 표지된 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 보관한다. 침전물을 APMA 폐기물로 표시된 용기에 버리십시오. SDS-PAGE는 R2DP 세포에서 BL21 DE3 세포로부터의 His-tag 프로MMP-3 촉매 도메인의 His-tag 정제 용출 분획을 비교하기 위해 실행되었다.
His-태깅된 MMP 촉매 도메인 및 BL21 DE3 세포의 처음 여덟 개의 용출 분획은 R2DP 세포에서 His-태깅된 MMP 촉매 도메인 내의 것보다 더 적은 단백질을 나타냈다. MMP3 CD 및 R2DP 세포의 유도, 재접힘, 농축, 활성화 및 탈염된 분획이 도시되어 있다. 활성화시, 활성화된 MMP-3 CD 밴드의 분자량은 약 20 킬로달톤이며, 이는 약 30 킬로달톤으로 남아있는 His-태깅된 효소원과 대조적이다.
세포 용해물을 원심분리할 때, 펠릿은 콤팩트하지 않을 수 있다. 그런 일이 발생하면 초음파 처리를하고 원심 분리기를 더 오래 수행하십시오. 단백질을 재농축 할 때 침전이 발생할 수 있습니다.
가용화 완충액에 녹이고 과정을 반복하십시오. 본원에 기재된 절차는 MMP 효소 활성의 분자 메카니즘을 이해하는데 결국 사용될 수 있는 활성 인간 MMP의 가용성 발현을 위한 상세한 방법을 제공한다. FPLC와 같은 대체 단백질 정제 방법은 MMP 단백질 정제를 수행할 수 있다.
