이 프로토콜은 인간 응용 프로그램에 대해 쉽게 수정할 수 있는 잠재적으로 새로운 치료 전략을 설명합니다. 이 기술은 직접 말초 림프구 조직에서 창자 호밍 조절 T 세포의 유도를 강화하고 매우 프로 염증 환경에서도 안정적으로 구현 될 수있다. 이러한 기술은 또한 말초 면역 계통 내의 활성 비타민 D와 비타민 A의 역할을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 시각적 데모는 이 기술의 성공에 중요한 고품질 엔지니어링 수지상 세포의 생성을 위한 단계별 지침을 제공합니다. CM-10-D 세포 배양 배지 의 20 밀리리터에서 7개의 293T 세포에 1회 10번 을 10번 시드하여 150x 25mm 배양판에서 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 24시간 배양플레이트를 배양한다. 다음 날, 새로 준비된 2배 농축 HBS 용액 1.62밀리리터, 봉투 플라스미드 9.5마이크로그램, 포장 플라스미드 17.5마이크로그램, 렌티-CYP-ALDH 플라스미드 27마이크로그램을 50밀리리터 원추형 튜브에 추가합니다.
튜브 내용물의 최종 부피량은 최대 3.0375 밀리리터에 물을 공급한 후 2개의 어금니 칼슘 염화물을 202.5 마이크로리터를 첨가합니다. DNA 강수 혼합물을 실온에서 20분 동안 그대로 두어 간헐적으로 혼합한 후 293T 배양당 3.24 밀리리터를 떨어뜨려 부드럽게 접시를 소용돌이치게 한다. 플레이트를 PBS로 부드럽게 세척하고 CM-4-D 배양 배지로 세포를 공급하기 전에 24 시간 동안 인큐베이터에 놓습니다.
또 다른 24 시간의 배양 후, 수퍼나티를 멸균 병으로 수확하여 섭씨 4~8도에서 보관하고 신선한 CM-4-D 배지로 세포를 24시간 동안 공급합니다. 4일째에는 수퍼네이츠를 다시 수확하고 3일 과 4일 부터 0.45 마이크로미터 필터로 슈퍼네이츠를 변형시다. 이어서, VSV-G 의사형 바이러스를 원심분리에 의한 24시간 동안 농축한다.
다음 날은 초월자를 장식합니다. 튜브가 멸균 바이오 안전 캐비닛에서 몇 분 동안 종이 타월에 배출한 다음 문화 접시당 5 %의 글리세롤을 함유 한 멸균 PBS의 33.3 마이크로 리터로 펠릿을 다시 분리하십시오. 골수 유래 수지상 세포 생성의 경우 BALB/c 마우스에서 수확한 심정과 대퇴골을 신선한 배양 배지를 함유한 100x 20mm 배양 접시에 넣습니다.
해부 가위와 집게를 사용하여 뼈에서 조직을 제거합니다. 모든 뼈가 청소되었을 때 가위를 사용하여 각 골격의 양쪽 끝을 잘라 골수 구멍을 노출시합니다. 30 게이지 바늘이 장착된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 15 밀리리터 튜브에서 골수를 수집하여 10 밀리리터의 신선한 배양 배지로 각 뼈를 플러시합니다.
모든 골수가 수집되면 골수를 원심분리에 의한 퇴적시키고 적혈구 용해 완충제의 2밀리리터에서 펠릿을 재보편하게 한다. 가끔 흔들림과 실온에서 4 ~ 5 분 후, 세포 배양 배지의 10 밀리리터와 반응을 중지하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. CM-10-R 배양 배지의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보중단하고 CM-10-R 배양 배지 농도의 밀리리터당 6개의 세포로 10배 씩 셀을 조절한다.
다음으로, 재조합 뮤린 GM-CSF의 밀리리터 당 100 단위와 IL-4의 밀리리터 당 10 단위를 세포에 추가합니다. 세포의 4 밀리리터를 6개의 우물로 접시에 넣고 37°C에서 배양하고 48시간 동안 이산화탄소를 5%로 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 부드럽게 비 부착 세포를 흡인.
추가 48 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 세포를 반환하기 전에 배양에 GM-CSF 및 IL-4로 보충 신선한 배지를 추가합니다. 두 번째 인큐베이션의 끝에서, 그들의 원심 분리를 위한 50 밀리리터 원추형 관으로 비 부착된 골수 유래 수지상 세포를 수확하십시오. BMDC-CYP-ALDH 세포를 생성하기 위해, CM-10-R 배지의 500 마이크로리터당 10내지 6개의 수지상 세포로 10배배기를 재중단하고, 새로운 6개의 음배양판의 각 웰에 500마이크로리터의 세포를 플레이트한다.
LENTI-CYP-ALDH 바이러스 50마이크로리터와 프로타민 밀리리터당 8마이크로그램을 각 웰에 추가한 다음 24시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 다음 날, 슈퍼네티를 신선한 배양 배지로 교체하고 판을 세포 배양 인큐베이터로 24시간 더 되돌려 보냅니다. 두 번째 인큐베이션의 끝에서, 세포는 기능 분석을 위해 수확하기 전에 24 시간 동안 잘 당 리포 폴리사카라이드의 밀리리터 당 100 나노그램으로 활성화 될 수 있습니다.
부모 골수 유래 수지상 세포에 비해, BMDC-CYP-ALDH 세포는 1 알파-하이드록실라제의 향상된 발현을 표시합니다. BMDC-CYP 및 BMDC-CYP-ALDH 세포의 배양 수퍼나츠에서 활성 형태의 비타민 D농도는 부모 골수 유래 수지상 세포 및 BMDC-ALDH 세포 배양에서 관찰된 것보다 약 20배 더 높습니다. 기판으로 처리된 BMDC-CYP-ALDH 세포의 평균 형광점 강도는 기판으로 처리된 부모 골수 유래 수지상 세포의 그보다 약 6배 더 높습니다.
이것은 BMDC-CYP-ALDH 세포가 현저하게 향상된 망막 탈화물 수소효소-2 효소 활성을 표현한다는 것을 건의합니다. 25-하이드록시 비타민 D와 망막으로 처리된 DC2.4 세포는 foxp3 양성 Cd4 양성 T 세포의 풍부에 큰 변화를 유도하지 않는다. 대조적으로, DC2.4 CYP-ALDH 세포는 25-하이드록시 비타민 D와 망막으로 처리된 농도 의존적인 방식으로 장 호밍 조절 T 세포의 상당히 높은 수를 유도한다.
또한, 내과음 주입제어세포에 비해 DC CYP-ALDH 세포는 BALB/c 수신자 동물에 대한 복막 주사 후 폭스P3 양성 CCR9 양성 CD4 양성 T 세포의 수가 현저한 증가를 유도한다. 절차의 성공은 건강한 T 세포와 올바르게 준비된 DNA 혼합물의 준비에 달려 있습니다.
