이 연구는 빅토리아 정부의 OIS 프로그램, 국민 건강과 호주 프로그램과 프로젝트 보​​조금의 의학 연구 협의회 (JPF 친 - 더스팅) 및 대학원 장학금 (D 미셸)에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 경동맥 동맥을 분리 <ol><li> CO 2 / O 2 질식을 통해 Euthanase10 주 오래된 스프 라그 돌리 쥐. </li><li> 최소 혈관의 스트레칭을 확보 대동맥과 마음으로 엑사이스 왼쪽과 오른쪽 경동맥 동맥 일반. </li><li> 얼음 차가운 크렙스 버퍼에서 대동맥과 심장에서 경동맥 동맥을 분리하고 닫습니다 절개를 수행합니다. </li><li> 장착하기 전에 얼음 크렙스에 고립된 선박 보관하십시오. </li></ol> 약. 시간 = 45 분 2. 마중물 선박 챔버 <ol><li> 37 버퍼를 통해 ° C.; carbogen 가스 (5 % CO 2 95% O 2) 일으키는 생리적 산도에서 유지 선박 챔버 플러시 크렙스 버퍼의 근위 및 말초 커넥터에서 </li><li> 튜빙을 보장하고 cannulas 완전 플러시되고 정렬됩니다. </li><li> P1 (근위)과 P2 (말초) 트랜스 듀서를 통해 Kreb 버퍼를 플러시. 트랜스 듀서에 공기 방울을 보장하지 닫기 두드린다. </li><li> 해당 커넥터에 트랜스 듀서를 연결하고 다시 기포가 보장되지 더 크렙스 버퍼를 플러시. 챔버에 도청 장치를 닫습니다. </li></ol> 약. 시간 = 15 분 3. 선박 챔버를 가압 <ol><li> 압력 장비를 켜고 : 압력 서보, 압력 모니터링, 연동 펌프 (그림 1). </li><li> 기포가 보장하지 20 mmHg (1 전화)에서 튜브를 통해 자동 실행 크렙스 버퍼에 대한 압력과 압력 서보에 연동 펌프. </li><li> 폐쇄 P2 변환기에 튜브를 연결합니다. 압력이 안정 될 것입니다. </li><li> 모든 거품이 다음 봉쇄 살아가기 위해 선박 실로 P2 탭을 엽니다. </li><li> 크렙스 버퍼 (- 7 ML 5)와 함께 목욕을 입력합니다. </li></ol> 약. 시간 = 10 분 4. 혈관을 장착 <ol><li> 각 정맥에 해부 현미경 장소 블랙 폴리에스터 넥타이 (그림 2)에서. </li><li> 분리 cannulas과 정맥 소유자로 이동 및 마운트 P1 정맥에 ¼ 혈관 (대동맥 아치 끝). 배가 찢어하지 확인하십시오. </li><li> 크렙스 버퍼가 가득 주사기를 사용하면 부드럽게 P1 변환기를 통해 선박 초과 혈액을 밖으로 몰아내. 챔버에 P1을 닫습니다. </li><li> 폴리에스터 넥타이 P1의 정맥에 안전하게 들어왔습니다. </li><li> P2 정맥에 장착을위한 cannulas / 가까이 정맥 홀더를 이동합니다. </li><li> 선박의 마운트 말초 끝 (~ ¼ 길이) 말초 정맥에. 폴리에스터 넥타이 고정합니다. </li></ol> 약. 시간 = 20 분 5. 혈관을 가압 <ol><li> 선박에 구부 리거나 스트레칭을 보장하지 정맥 홀더를 조정합니다. </li><li> P1과 P2는 실로 폐쇄와 함께 설명서를 자동에서 압력 서보를 전환합니다. 10 초 이내에 압력에 지속적인 감소가 없습니다 압력 서보를 확인합니다. 있다면, 누수가 발생하고 연결 및 트랜스 듀서는 장소에서 확보해야합니다. </li><li> 실로 자동으로 누른 다음 열기를 P2로 다시 압력 서보를 조정합니다. 현미경 수돗물이 실로 열 때 혈관이 팽창 관찰합니다. </li><li> 수동으로 압력 서보 스위치. 10 초 이내에 압력 지속적인 감소에 다시 확인하십시오. 누설이있다면 시스템이 꽉 압력 용기에 구멍 될 가능성이있다 없습니다. </li><li> 챔버에 자동으로 열 P1로 다시 전환합니다. 수동 설정에 대한 압력이 안정 남아 있는지 확인합니다. </li><li> 경우 수동 설정을 증가 다이얼 2 (40 mmHg)에 아무 누출도. </li><li> 자동으로 조정하여 현미경으로 혈관을 관찰. 필요한 경우, 수동 설정에 누출 vessel.Check에 굽힘을 보장하지 정맥 홀더를 조정합니다. </li><li> 5.7 원하는 압력에 도달할 때까지, 3 (60 mmHg) 4 (80 mmHg)과 정도 다이얼을 증가 - 단계 5.6를 반복합니다. </li></ol> 약. 시간 = 15-30 분 6. 압력 용기를 잠복기 <ol><li> 37 온도 컨트롤러 세트 ° C.에 연결 </li><li> 선박 챔버 욕조에 두 번째 연동 펌프 perfuse 크렙스 버퍼 (1 ML / 분)와 함께. </li><li> 목욕 단 상단 레이어를 보장 실로 흡인기가 제거 연결합니다. </li><li> 자동으로 설정 압력을 1 시간 동안 37 ° C에서 압력 용기를 품어. </li><li> 압력이 주기적으로 (수동으로 전환) 유출되지 않습니다 확인하십시오. </li><li> 다양한 약리 개입의 효과는 단순히 부화 동안 목욕하는 화합물을 추가하여 볼 수 있습니다. </li></ol> 약. 시간 = 1시간 7. 전체 피가 압력 용기를 Perfusing <ol><li> 배양 기간 동안 적어도 7.5 ML 인간의 전체 혈액 / 40 U의 헤파린 / ML 혈액 수집 혈관을 구하십시오. 37 50 ML 팔콘에 품어 ° C. </li><li> 십분 t의 끝나기 전에37 그가 10 분 VybrantDil (1:1000)와 인큐베이션 레이블 혈액 ° C 어둠 속에서. </li><li> 십분 후에 모든 거품을 삭제 주사기로 혈액을 수집하고 37 세트 열 자켓 ° C.있는 주사기 펌프에 부착 </li><li> 챔버 / 선박에 P1 변환기를 닫고 주사기 및 폐기물 튜빙을 연결합니다. </li><li> 1000 μL / 모든 거품을 제거하기 위해 폐기물 튜브를 통해 분 정화 혈액. </li><li> 실로 P1을 엽니다. 압력 서보 원하는 압력을 유지하기 위해 자동으로 조정합니다. </li><li> 100 μL / 분 피를 Perfuse. </li><li> 디지털 카메라 레코드 하나에 15 초간 perfused 선박의 두 분야, 3, 5, 7.5 및 10 분 결합 형광 현미경을 사용합니다. </li><li> 포스트 재관류 내피 무결성 및 기능 등 myograph 및 유착 분자 발현이 더욱 염증 반응을 확인할 수 immunohistochemistry에 의해 결정될 수있는 약리 기술로 평가하실 수 있습니다. </li></ol> 약. 시간 = 15 분 8. 대표 결과 : 압력 챔버 설정의 구조 다이어그램은 그림 1에 표시됩니다. 형광 현미경 결과를 결합하여 디지털 카메라는 라이브 비디오 레코딩을 통해 즉시 시각 수로. 대표 영상은 leukocytes는 그들이 10 초 고정 남아있는 경우 내피에 자기편 것으로 간주되어 그림 3에서 볼 수 있습니다. 연속 루프 준수 세포에서 비디오 레코딩과 평균마다 필드로 계산하실 수 있습니다. 모두 낮은 (그림 3A)와 높은 (그림 3B) 압력이 접착력의 일부 금액을 일으킬 수 있지만 높은 intraluminal 압력 백혈구 유착에 상당한 증가를 볼 수 있습니다이도 (그림 4) 양적 증명입니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> 그림 1. Pressurised 전직의 생체내 선박 챔버의 약도. 근위 (P1) 변환기 및 선박 내에서 조작으로 혈압을 가능하게하는 말초 (P2) 트랜스 듀서에 연결된 cannulated 들어왔습니다. 재관류가 P1 변환기 및 압력 통해이 P2 변환기를 통해 유지됩니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> 그림 2. 유대와 Cannuala. 블랙 폴리에스터 넥타이는 각 정맥에 붙어 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 영상. 80 mmHg (A) 120 mmHg에서 형광에 따라 동적 세포 접착 (빨간색 화살표) (B) 재관류 10 분 후. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> 그림 4. 스프 라그 돌리의 백혈구 유착 1 시간 낮은에서 보육 (80 mmHg)과 고압 (120 mmHg) 이후 동맥 경동맥. ** P &lt;0.001로 Bonferroni 게시물 임시 테​​스트를 사용하여 양방향 반복 측정 ANOVA로 분석했다.

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연구 프로토콜은 알프레드 의학 연구 및 교육 프리싱트 동물 윤리위원회와 알프레드 병원 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

이것은 실시간으로 가압 조건 하에서 그대로 고립 혈관의 내피에 백혈구 유착을 공부하는 수정 방법입니다. 혼자 선박 챔버의 재관류 대형 쥐 및 쥐 선박의 프로 염증성 계통의 빠른 확인이 가능합니다. 사용 압력 조작은 동적 세포 상호 작용을함으로써 더 나은 모방 - 대답은 매우 높은 생리 intraluminal 압력, 그리고 pathophysiological 조건에 낮은에서 관찰 수 있습니다. 혈관의 직경도 충분한 셀 이미징 프로그램을 사용하고 있으므로 전단 흐름과 속도가 결정되므로 조절할 수 측정할 수 있습니다. 그 myograph 기능, 욕실에 배치 약리 중재는이 모델이 기계론의와 신호 경로의 연구를 활성화 가능 실험 조건에 또 다른 차원을 추가합니다. 내피 보존이 압력 조작하는 동안 확인되지 않을 수 있지만, ACH 및 PE에 대한 답변이 게시물 재관류 9 실시하실 수 있습니다. 이것이 설치가 휴대 전화의 상호 작용하지 타악기 혈액의 흐름이나 수축기 또는 diastolic 압력의 영향에 intraluminal 압력의 효과를 보여주는 것을인지해야합니다. 백혈구 유착에 대한 급성 압력의 변화가 관찰 동안 또한,이 설정은 또한 만성 압력 효과 (즉, 배양 시간을 증가하고 만성 압력 동물 모델을 사용)를보고 활용하실 수 있습니다. 스프 라그 돌리 일반적인 경동맥 동맥이 설정에서 보여주지만 다른 변종과 종의은 정맥의 크기에 적절한 조정과 함께 사용할 수 있습니다. 실제로, 동물의 연령 및 체중은 설정가 각 선박에 대한 개별 수 있어야함을 따라서 선박의 크기에 영향을하고 있습니다하는 것이 중요합니다. 결합 조직의 닫고주의 절개는 대단히 leukocytes의 시각화를 향상시킬 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구, Inc의 </td><td> STEREO 디스커버리 V.20 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 2000 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> 디지털 카메라 및 컨트롤러 </td><td> 하마 마츠 오르카 - ER </td><td> C4742 - 95 </td><td></td></tr><tr><td> 형광 조명 시스템 </td><td> 루멘 역학 </td><td> X - 120 인용 </td><td></td></tr><tr><td> 선박 회의소 </td><td> 시스템 계측 생활 </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> 압력 서보 컨트롤러 및 연동 펌프 </td><td> 시스템 계측 생활 </td><td> PS - 200 </td><td></td></tr><tr><td> 재관류 압력 모니터 </td><td> 시스템 계측 생활 </td><td> PM - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 X 압력 변환기 </td><td> 시스템 계측 생활 </td><td> 태평양 표준시 - F </td><td></td></tr><tr><td> 온도 컨트롤러 </td><td> 시스템 계측 생활 </td><td> TC - 01 </td><td></td></tr><tr><td> 연동 펌프 </td><td> Instech 연구소 병원 </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil 셀 - 라벨링 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> V - 22885 </td><td> 1:1000를 사용하여 </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

전세계, 고혈압은 인구의 약 분기로보고하고 사망률 전세계를위한 최고의 바이오 메디컬 위험 요소입니다. vasculature 고혈압에 내피 기능 장애와 죽상 경화증과 같은 만성 신장 질환 2, 뇌졸중 3 심장 마비 4와 같은 다양한 질병 상태에 선도적인 증가 염증과 관련된 것입니다. atherogenesis로 이어지는 혈관 염증의 초기 단계는 내피를 통해 압연, tethering, 준수 및 leukocytes의 후속 윤회과 관련된 유착 폭포입니다. 내피에 leukocytes의 채용과 축적 그러한에서 혈관 세포 접착 분자 - 1 (VCAM - 1), 세포 세포 접착은 분자 - 1 (ICAM - 1)과 E - selectin뿐만 아니라 증가로 접착 분자의 upregulation에 의해 중재됩니다 시토킨 및 케모카인 릴리스와 반응 산소 종의 upregulation 5. 같은 정적 유착 assays으로 체외 방식의 휴대 전화 부착에 관련된 메커니즘뿐만 아니라 세포 유착 분자의 분석을 결정하는 데 도움이됩니다. 체외 연구에서 이전에 사용된 방법은 내피에 압력 급성 증가는 단핵구 유착, 6 단, 체외의 assays 많은 마찬가지로, 이러한 결과가 실시간으로 수행되지 않은 접착 분자와 염증 마커의 upregulation로 이어질 수있다는 증명 생리적 흐름 조건 하에서 않으며, 전체 혈액과 함께. 따라서, 생체내의 assays에 점점 혈관 염증 및 플라크 개발을 증명하기 위해 동물 모델로 활용하고 있습니다. Intravital 현미경 지금은 널리 백혈구 유착, 압연, 마이 그 레이션과 윤회 7-9을 평가하는 데 사용됩니다. 생체내 연구에 내피 부착하는 백혈구에 대한 압력의 효과를 결합하면 광범위한 것은 덜 수 있습니다. 한 이러한 연구는 immunohistochemistry 10을 통해 평가되었다 동맥 성장과 리모델링하지만 염증성 마커에 대한 흐름과 전단의 실시간 효과를 검사합니다. 여기 우리는 전체 혈액 관류를 사용하여 가압 그대로 혈관에 실시간으로 백혈구 유착을 기록에 대한 모델을 제시한다. 방법론은 그대로 혈관에서 백혈구 - 내피 접착 상호 작용의 실시간 분석을 가능하게 전직 생체내 선박 챔버 재관류 모델 9 수정입니다. 우리 수정 intraluminal 압력뿐만 아니라 생리 흐름 조건뿐만 아니라 압력 조건 하에서 연구에 대한 허용 최대 200 mmHg의 조작이 가능합니다. 압력 myography 시스템은 이전에 혈관 벽 및 루멘 직경 11뿐만 아니라 혈관 수축을 관찰하기 위해 입증되었습니다 동안이 실시간으로 백혈구 - 내피 상호 작용을 보여주는 이번이 처음이다. 여기 쥐가에서 수확하고 형광 현미경을 결합 맞춤 제작 흐름 실로 cannulated 경동맥 동맥을 사용하는 방법을 보여줍니다. 선박 챔버는 이미지를 배가하기 위해 짧은 작동 거리와 큰 직경의 객관적인 렌즈를 허용하는 큰 바닥 coverglass 갖추고 있습니다. 또한, 선택한 작용제 및 / 또는 antagonists가 추가로 세포 접착을 조절하는 메커니즘을 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다. intravital 현미경을 통해이 방법의 장점은 침략적 수술에 대한 개입을 포함하지 않으며 따라서 더 높은 처리량을 얻을 수 있습니다. intravital은 체계 억제제 치료를 가능하게하는 반면이 방법은 원하는 그릇에 현지 억제제 치료의 사용을 수 있습니다.

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K 조회수.  Monash University. 이것은 수확 가압 혈관의 내피에 백혈구 유착을 시각화하는 방법입니다. 기술은 따라서 고혈압의 pathophysiological 조건을 모방 - 대답은 200 mmHg로 intraluminal 압력을 각기 다른 전단 흐름에 따라 혈관 접착력을 공부하고 있습니다.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

파지 - 표시 합성 항체 라이브러리의 확장 성 높은 처리량 선택

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...