이 프로토콜은 전사 인자 코딩 유전자의 에피토프 태깅부터 전산 데이터 분석을 통한 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링을 수행하는 것에서부터 CUT&RUN을 통해 칸디다 알비칸스에서 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링을 수행하는 모든 실험 절차를 상세히 기술한다. 이것은 더 접근하기 쉽고, 빠르고, 민감하고, 덜 비싼 기술이며, 기존의 ChIP-chip 및 ChIP-seq 접근법보다 더 높은 품질의 데이터를 제공합니다. 우리의 프로토콜은 생물막 또는 플랑크톤 배양물에서 분리 된 칸디다 알비 칸스 세포를 위해 개발되었지만 거의 모든 좋은 형태의 칸디다 알비 칸스 세포에 적응시키는 것이 실용적이어야합니다.
세포 현탁액을 인큐베이션한 후, 다섯 마이크로리터 분취량을 새로운 PCR 튜브 내로 옮긴다. 다섯 마이크로 리터의 분리 된 핵과 이전에 섭씨 네 도에 저장된 손상되지 않은 세포의 5 마이크로 리터 분취량에 calcofluor-white 및 SYTO 13의 각각 하나의 마이크로 리터를 추가하십시오. 어둠 속에서 섭씨 30도에서 30 분 동안 배양하십시오.
형광 현미경을 사용하여 분리된 핵의 완전성과 순도를 육안으로 검사한다. 눈에 띄는 SYTO 13 염색을 나타내는 단리된 핵을 찾고 칼코플루오르-백색 염료에 의한 세포벽 염색이 없는지 확인하십시오. 칼코플루오르-백색 염료로 세포벽 염색을 위한 대조군으로서 무손상 세포로 검사를 반복한다.
튜브를 마그네틱 랙에 놓고 슬러리가 완전히 깨끗해질 때까지 기다리십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 50 마이크로 리터의 항체 완충액을 넣고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오.
세 마이크로리터의 항-GFP 폴리클로날 항체를 튜브에 첨가하고, 튜브를 섭씨 4도의 너트 믹서에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 튜브를 실온에서 100 배 g에서 5 초 동안 간단히 원심분리하고 튜브를 자기 랙 위에 놓습니다. 슬러리가 맑아지면 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오.
비드가 있는 튜브가 여전히 마그네틱 랙에 있는 동안, 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼를 비드에 직접 첨가하십시오. 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼로 두 번의 세척을 반복하십시오.
50 마이크로 리터의 얼음 차가운 세포 투과 버퍼를 각 튜브에 넣고 피펫팅으로 부드럽게 섞으십시오. 2.5 마이크로리터의 단백질 AG-MNase를 각 샘플에 첨가하고 피펫팅하여 혼합한다. 샘플을 섭씨 4도의 너트 믹서 상에 놓고 샘플을 한 시간 동안 인큐베이션한다.
스트립 튜브를 실온에서 100 배 g에서 5 초 동안 간단히 원심분리 한 다음 튜브를 자기 랙에 놓습니다. 슬러리가 맑아지면 피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 비드가 있는 튜브가 여전히 마그네틱 랙에 있는 동안, 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼를 비드에 직접 첨가하십시오.
피펫을 사용하여 상층액을 버리십시오. 얼음처럼 차가운 세포 투과 버퍼로 두 번의 세척을 반복하십시오. 얼음처럼 차가운 세포 투과 완충액 100 마이크로리터를 시료에 넣고 다섯 번 위아래로 부드럽게 피펫을 만듭니다.
젤 상자에서 젤 캐스트를 제거하고 제조업체의 지침에 따라 젤 캐스트를 엽니 다. 겔 캐스트에서 겔을 부드럽게 제거하고 100 밀리리터의 단일 강도 TBE가 들어있는 젤 유지 트레이 안에 넣으십시오. 핵산 젤 얼룩 10 마이크로 리터를 트레이에 넣고 부드럽게 소용돌이 치십시오.
빛으로부터 보호하기 위해 호일로 덮고 실온에서 10 분 동안 정적으로 배양하십시오. 그런 다음 100 밀리리터의 탈 이온수로 젤을 두 번 헹구십시오. 호박색 필터 커버를 사용하여 청색광 조명 아래에서 젤을 이미지화하십시오.
각 라이브러리에 대해 젤을 약 125 염기쌍 눈에 띄는 어댑터 이량체 밴드 위와 400 염기쌍 사다리 마크 아래로 약간 자릅니다. 22 게이지 바늘을 사용하여 0.65 밀리리터 튜브의 바닥에 구멍을 뚫고 뚫린 튜브를 멸균 된 2 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브 안에 넣으십시오. 겔 슬라이스를 두 밀리리터 마이크로퍼지 튜브 내부의 뚫린 튜브로 옮깁니다.
0.65 밀리리터 천공 튜브 및 샘플을 함유하는 두 밀리리터 마이크로퍼지 튜브를 실온에서 10, 000 배 g에서 2분 동안 원심분리하여 두 밀리리터 마이크로퍼지 튜브 내부의 겔 슬러리를 수집한다. 300 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 겔 용출 완충액을 겔 슬러리에 첨가한다. 실온에서 너트 레이터에 최소 세 시간 또는 하룻밤 동안 혼합하십시오.
모든 액체 및 겔 슬러리를 0.22 마이크로미터 필터 컬럼으로 옮기고 실온에서 1분 동안 10, 000 배 g에서 원심분리한다. GitHub 페이지에서 녹색 코드 버튼을 클릭한 다음 ZIP 다운로드 옵션을 클릭하여 CUT&RUN 분석의 소스 코드를 다운로드합니다. 폴더의 압축을 로컬 컴퓨터의 관련 위치에 풉니다.
콘다 환경을 설치하고 한 번만 실행하십시오. Conda가 설치되면 관련 명령과 함께 제공되는 가상 환경을 만듭니다. 이 워크플로가 실행될 때마다 가상 환경을 활성화합니다.
세포벽 소화 및 핵 완전성은 대조군 무손상 세포 및 형광 세포벽 및 핵산 염색으로 염색된 단리된 핵 둘 다를 가시화함으로써 평가되었다. 세포벽 염색이 관찰되지 않는 단리된 무손상 핵과는 달리, 핵과 세포벽 모두 무손상 대조군 세포에서 형광으로 표지된다. 그림은 모세관 전기영동 장비를 사용하여 분석된 CUT&RUN TF 라이브러리를 보여줍니다.
성공적인 CUT&RUN TF 라이브러리는 200개의 기본 쌍보다 작은 짧은 조각에 대해 보강됩니다. 차선책의 CUT&RUN TF 라이브러리는 큰 DNA 단편에 대한 농축을 보여줍니다. 본원의 도면은 Ndt80 DNA 결합 모티프가 CUT&RUN에 의해 확인된 모든 Ndt80 결합 유전자좌에 걸쳐 풍부하다는 것을 보여주며, 이는 이 방법론에 의해 확인된 추가적인 피크가 보나피드 Ndt80 결합 부위일 가능성이 있음을 나타낸다.
비교 분석은 CUT&RUN 프로토콜이 생물막 형성 동안 Ndt80 및 Efg1에 대해 이전에 알려진 대부분의 결합 사건을 확인했음을 나타냈다. 전반적으로, 유전자좌에 결합된 Ndt80 및 Efg1 둘 모두는 이전에 공개된 크로마틴 면역 침전 ChIP 데이터와 중첩되며, CUT&RUN을 통해서만 확인된다. 이를 통해 전사 규제 네트워크와 칸디다 알비칸에 초점을 맞춘 연구의 범위와 속도를 크게 높일 수 있습니다.
