이 방법은 질병 및 꾸준한 상태 동안 시냅스에서 성상 세포 상호 작용의 평가를 위한 매우 미세한 성상세포 과정의 시각화를 용이하게 하는 데 사용할 수 있다. 이 기술은 또한 어떤 마우스 모형, 세포 인구, 또는 두뇌 지구에 적용될 수 있습니다. 적절한 저항으로 날카로운 전극을 준비하려면 마이크로 피펫 풀러에 필라멘트가 있는 보로실리케이트 유리 단일 배럴 전극을 당깁니다.
먼지가 팁에 들어가는 것을 방지하고 팁이 파손되지 않도록 상자 의 바닥에서 높은 전극을 유지하기 위해 밀폐 된 용기에 당겨진 전극을 저장합니다. 루시퍼 옐로우 염료 용액으로 전극을 채우기 위해 팁이 아래쪽으로 향하는 수직 위치에 전극을 배치하고, 파이펫 1~2개의 마이크로리터의 피펫을 전극 의 뒷면에 넣습니다. 용액이 모세관 작용을 통해 팁으로 이동하기 까지 5~10분 정도 기다린 후 전극 내부의 용화물 노란색과 접촉하는 전극 홀더의 은색 와이어와 연결된 전극 홀더에 채워진 전극을 부드럽게 고정하십시오.
염료 배출 테스트를 위해 가볍게 고정된 뇌 슬라이스를 실온에서 0.1 대구 PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 부드럽게 놓고 나일론 끈이 달린 백금 하프로 슬라이스를 제자리에 고정시십시오. 전극을 전압 소스에 연결하고 접지 전극을 뇌 슬라이스를 포함하는 욕조에 배치합니다. 공초점 현미경의 목표를 관심 있는 뇌 영역으로 이동하고 전극을 10X 수질 침지 렌즈를 사용하여 용액으로 낮추고 전극을 시야의 중심으로 이동시합니다.
밝은 필드 조명 아래에서 40X 수질 침수 렌즈로 전극을 주의 깊게 검사하여 전극이 투명하고 파편이나 거품없이 나타나도록 하십시오. 488 나노미터 레이저로 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법으로 전환합니다. 12볼트에서 자극기를 켜서 염료 배출을 테스트합니다.
대형 형광염염분 구름은 전극 의 끝 주위에 표시되어야 합니다. 그런 다음 밝은 필드 아래에서 천천히 전극을 슬라이스쪽으로 낮추고 표면 바로 위에 멈춥춥시다. 이온토포레시스로 관심 있는 성상세포를 채우려면 적외선 차동 간섭 대비를 사용하여 길쭉한 타원형 소마타가 있는 성상세포에 직경 약 10마이크로미터, 슬라이스 표면 아래 40~50마이크로미터를 식별합니다.
이것은 피라미드 세포 층 바로 아래 해마의 지층 방사체입니다. 우리가 조직을 통해 이동할 때, 우리는 혈관, 신경 세포, 성상 세포 및 그밖 세포 모형을 볼 수 있습니다. 성상세포가 선택되면, 세포를 시야 의 중심으로 이동하고 천천히 전극 팁을 슬라이스로 낮추고 전극이 세포 몸과 동일한 평원에 될 때까지 조직을 탐색합니다.
성상세포의 세포 본체가 명확하게 보이고 윤곽을 드러내면, 천천히 부드럽게 전극을 앞으로 전진시키고, 팁이 세포의 소마를 뚫을 때까지 전극을 움직입니다. 전극이 소마 내부에 있는지 주의하기 위해 목표의 초점을 천천히 위아래로 이동합니다. 전극 끝이 세포 내부에 있으면 0.5 ~1볼트의 자극기를 켜서 전류를 지속적으로 셀로 배출합니다.
공초점 현미경을 사용하여, 세포 필름을 보고, 디지털 줌을 증가시켜 세포의 세부 사항을 시각화하고 전극의 끝이 필요에 따라 셀 내부에 보이는지 확인합니다. 전압을 끄고 셀에서 전극 끝을 부드럽게 철회하기 전에 미세한 가지와 프로세스가 정의 될 때까지 약 15 분 동안 기다립니다. 채워진 셀을 이미지하기 위해, 세포가 원래 의 형태로 돌아갈 때까지 15~20분 기다린 후 공초점 현미경의 설정을 조정하여 40X 목표에 따라 미세한 분기와 프로세스가 정의된지 확인합니다.
0.3 마이크로미터의 스텝 크기로 Z 스택을 설정하고, 세포에서 신호가 없을 때까지 이미징하는 동안 목표를 이동하고 해당 단계를 정상으로 설정합니다. 그런 다음 신호를 볼 때까지 셀을 통해 초점을 맞추고 목표를 아래로 이동하고 해당 단계를 바닥으로 설정합니다. 이미징이 완료되면 전극에서 염색 배출을 확인합니다.
큰 염료 구름이 나타나면 전극을 다음 슬라이스에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 전극을 교체하십시오. 최대 강도 투영을 생성함으로써 해당 도메인의 성상세포 구조에 대한 자세한 뷰를 관찰할 수 있습니다.
성상세포로 4X 크기 확대하면 하나의 주요 분기, 여러 보조 분기 및 주변 분기 및 전단지의 분포의 최대 강도 투영을 알 수 있습니다. 여기서CA1 성상세포의 원본 이미지가 표시됩니다. 세포 체, 주요 분기, 프로세스 및 성상세포에 의해 동봉된 영토 부피는 이러한 후속 이미지에서 재구성됩니다.
재건이 만들어진 후, 소마, 전체 세포 및 영토의 양이 정량화되었다. 그리고 주요 지점의 수는 계산되었다. 중간 성상 세포 필라멘트를 라벨세포 켈레탈 단백질로 세포 소마, 주요 분기 및 일부 이차 성상세포 가지에서 발현되지만 미세한 가지 및 공정에서는 발현되지 않습니다.
이 대표적인 분석에서는, 신경교 세동산 단백질에 의해 표지된 1 차적인 분기의 수및 그 루시퍼 노란색에 의해 그 시각화에서 중요한 다름이 발견되지 않았습니다. 또한, 글리아 세동 산성 단백질에 의해 표지된 성상세포의 세포 면적 및 부피는 루시퍼 옐로우로 시각화된 면적 및 부피보다 현저히 작었으며, 글리아 세동 산성 단백질은 주요 분기를 표지하는 신뢰할 수 있는 마커이지만 세포의 전체 영역 또는 부피를 결정하는 데 유용하지 않다는 것을 입증하였다. 전극 끝에서 방출되는 염료의 양은 염료의 꾸준한 스트림이 배출될 수 있을 만큼 충분히 높아야 하는 전극 저항에 달려 있다.
향후 연구는 초분해성 광 현미경 검사법에 의해 또는 성상세포 구조 내의 특정 단백질의 발현의 면역조직화학적 분석에 의해 성상세포 구조의 다른 성분을 검사할 수 있다.
