이 연구는 쥐의 폐동맥과 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 폐내 동맥의 혈관 반응을 조사하기 위해 장기 목욕 기술을 사용하는 것과 같은 여러 실험 프로토콜이 사용되었습니다. 폐동맥 및 혈관 평활근 세포는 혈관 생리학 및 병태생리학을 연구하는 훌륭한 모델입니다.
이 기술의 적응은 모든 약물, 추출물 또는 식물 화학 물질의 혈관 반응을 평가할 수 있습니다. 분리된 폐내 동맥 링을 장기 욕조에 장착하면 분리된 폐내 동맥을 사용하여 폐 고혈압을 포함한 다양한 질병을 조절하는 약물의 역할을 평가할 수 있습니다. 실험 프로토콜은 기술적으로 실현 가능하지만 중요한 단계는 복잡하고 성공을 위해 필수적이므로 시각적 데모가 있으면 더 쉽게 이해하고 따를 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 나레수안 대학교 의과대학 생리학과 심혈관 연구 단위 실험실의 생리학 석사 학위 학생인 Kittiwoot To-on입니다. 11cm 가위로 폐의 단일 엽을 자르고 폐의 내측 또는 뿌리가 위쪽을 향하도록 9cm 페트리 접시에 놓습니다. 정맥, 기관지 및 동맥의 정렬을 위에서 아래로 관찰하고 식별합니다.
가위로 기관지를 세로로 자릅니다. 그런 다음 11 센티미터의 집게를 사용하여 기관지 끝을 잡습니다. 부드럽게 해부하고 폐에서 기관지와 정맥을 제거하십시오.
집게를 사용하여 폐내 동맥의 끝을 잡고 가위로 폐 조직에서 조심스럽게 해부하십시오. 장기 욕조 어셈블리가 설정 될 때까지 격리 된 폐내 동맥을 차가운 Krebs 용액에 보관하십시오. 폐내 동맥을 분리 한 후 11cm 가위로 폐내 동맥의 주요 가지를 세로로 자르고 2mm 스트립으로 자릅니다.
폐내 동맥 스트립을 DM에 담근 다음 밀리리터 파파인당 1밀리그램, 0.04%BSA 및 0.4밀리몰 DTT를 포함하는 DM에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 스트립을 배양합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. DM에 콜라게나제 유형 IA의 밀리리터 당 1 밀리그램을 첨가하고, 다시 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양한다.
조직을 신선한 DM으로 옮기고 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드러운 분쇄로 분산시킵니다. 분리된 혈관 평활근 세포가 현미경으로 목욕 용액에서 보일 때까지 계속 마찰을 빚습니다. 앞에서 설명한 것처럼 폐내 동맥을 분리하고 폐내 동맥의 주요 가지를 약 2mm 길이의 고리로 자릅니다.
장기 목욕 챔버의 폐내 동맥 링을 직경 40마이크로미터 스테인리스 스틸 와이어 2개에 끼워 부착합니다. 폐동맥 링이 장착된 스테인리스 스틸 와이어를 데이터 수집 장치 및 데이터 기록 및 분석에 적합한 생리학적 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 시스템에 연결된 등척성 힘 변환기에 연결합니다. 그런 다음 폐내 동맥 링의 장력을 1 그램으로 부드럽게 올립니다.
용기 세그먼트가 1g의 휴식 장력에서 약 45분 동안 평형을 이루도록 합니다. 평형 기간 동안 Krebs 솔루션이 15분마다 정기적으로 변경되는지 확인하십시오. 평형 후, 높은 세포 외 칼륨 용액에 대한 혈관 수축을 측정하여 혈관의 생존력을 테스트하십시오.
PE로 사전 계약된 고리에서 아세틸콜린에 대한 이완 반응을 계산하여 내피의 유무를 평가합니다. 혈관내부를 작은 철사로 부드럽게 문질러 내피를 기계적으로 제거하여 탈질을 유도합니다. 그런 다음 시험 실험 시작 전에 30 분 동안 동맥 고리를 평형화하십시오. PE로 폐동맥 고리를 전수축시켜 식물 추출물의 이완 효과를 조사하십시오. 그런 다음 식물 추출물 밀리리터당 0.1 내지 1000마이크로그램을 내피 온전한 고리 및 내피 탈질 고리에 누적하여 혈관 이완을 유도하고 농도 의존적 반응 곡선을 획득한다.
용매로서 사용되는 효과적인 DMSO가 또한 음성 대조군으로서 작용하도록 유사하게 평가되는지 확인한다. 텍스트 원고에 언급 된대로 식물 추출물의 혈관 이완 작용 메커니즘을 평가하십시오. 그런 다음 PE로 수축 안정화 된 후 식물 추출물의 누적 농도를 첨가하십시오.
억제제가 없는 폐동맥 고리의 반응과 비교하여 억제제가 있는 상태에서 폐동맥 고리의 이완 백분율로서 식물 추출물의 효과를 제시하고 농도 반응 곡선을 구성합니다. 내피 손상되지 않은 폐내 동맥에서 식물 추출물은 혈관 이완의 농도 의존적 반응을 유도했습니다. 내피의 박멸은 EC50의 2.2배 증가에 의해 반영된 바와 같이 식물 추출물에 의해 유도된 혈관 이완을 근본적으로 감소시켰고, eNOS 및 EDHF의 억제는 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응을 분명히 감소시켰다.
이로 인해 농도 반응 곡선이 오른쪽으로 이동하고 Emax 값을 변경하지 않고 EC50이 증가했습니다. 반대로, Indomethacin은 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응에 영향을 미치지 않았다. 내피 탈질 폐내 동맥 고리에서 칼슘 활성화 칼륨 채널 차단제는 식물 추출물에 대한 혈관 이완제 반응을 감소시켰다.
전압 게이트 또는 ATP에 민감한 칼륨 채널의 차단제는 편차를 나타내지 않았습니다. 식물 추출물을 사용한 예비 배양은 염화칼슘 유도 수축을 억제하였다. 칼슘이 없는 크렙스 용액과 PE로 사전 배양된 내피 탈질된 폐내 동맥 고리는 일시적인 수축을 일으켰습니다.
비히클과 비교하여, 식물 추출물은 PE에 의해 유도된 수축을 상당히 감소시켰다. 시술 중에는 정맥, 기관지 및 동맥을 조기에 명확하게 식별해야 합니다. 동맥을 절단하거나 손상시키면 길이가 줄어들고 혈관 반응에 영향을 미칩니다. 이 기술은 폐동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 질환 치료를위한 프로토 타입으로 사용될 수있는 화합물을 조사하는 데 적용될 수 있습니다.
