당사의 프로토콜은 가벼운 수성 기반 반응 조건에서 단일 단계 가교 결합 및 공중합 기술로 100나노미터 미만의 단백질 부하 나노겔을 합성하는 데 있어 상당한 발전을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 온화한 조건에서 단백질이 탑재된 나노겔을 합성하고 가혹한 유기 용매와 고온을 피하여 생물학적 페이로드의 무결성을 보존하는 능력에 있습니다. 여과된 탈이온수로 유리 제품을 세척하는 것으로 시작합니다.
유리 제품을 건조시키려면 흄 후드 측면에 있는 압축 공기 배출구에 고정 노즐을 부착하십시오. 바이알을 단단히 잡고 노즐을 내부에 배치한 다음 압축 공기를 활성화하여 제어된 스트림을 방출합니다. 다음으로, 10밀리리터 유리 바이알에 탈이온수를 채우고 고무 격막으로 밀봉합니다.
물을 탈산소화하려면 풍선에 질소 가스를 채우고 풍선에 바늘을 연결합니다. 격막에 놓고 고무 격막을 뚫어 질소가 흐를 수 있도록 합니다. 또한 배출 바늘을 플라스크에 부착하여 일관된 질소 흐름을 유지합니다.
다음으로, BSA 또는 Cy7 태그 BSA를 탈산소화된 탈이온수에 용해시킵니다. 그런 다음 이 용액을 깨끗한 10밀리리터 유리 바이알에 추가합니다. 플라스크에 AETC 용액을 넣고 다른 고무 격막으로 밀봉합니다.
아크릴아마이드와 탈산소화된 탈이온수를 녹이고 이 용액을 바이알의 혼합물에 첨가합니다. 그런 다음 이황화 가교제를 탈이온수에 용해시키고 바이알의 혼합물에 첨가합니다. 질소 가스로 혼합물을 20분 동안 씻어냅니다.
그 후, SDS를 탈산소화된 탈이온수에 용해시킨다. 질소 가스 플러시 주사기를 사용하여 혼합물에 주입합니다. 다음으로, 반응 혼합물에 TEMED를 첨가합니다.
혼합물을 질소 가스의 연속적인 흐름 하에서 3분 동안 탈산소화합니다. 과황산암모늄을 탈산소화된 탈이온수 1밀리리터에 용해시키고 반응 혼합물에 도입합니다. 그런 다음 플라스크를 질소 분위기 아래에서 밀봉하고 혼합물을 실온에서 3시간 30분 동안 저어줍니다.
반응을 종료하려면 플라스크에서 씰을 제거하십시오. 혼합물이 투명하고 무색이 되면 반응이 끝납니다. 나노겔을 정제하려면 반응 혼합물을 15밀리리터 원심 필터 장치에 첨가합니다.
장치에 탈이온수와 원심분리기를 채워 반응성이 없는 화학 물질이나 캡슐화되지 않은 페이로드를 제거합니다. 원심 장치에 탈이온수 2ml를 추가하여 나노겔 샘플을 희석합니다. 캡슐화된 단백질의 분해를 방지하기 위해 최종 샘플을 섭씨 2도에서 8도까지 보관하십시오.
분석을 위해 큐벳 또는 일회용 접힌 모세관 세포를 사용합니다. 탈이온수 필터로 청소한 다음 압축 공기를 불어넣어 큰 먼지 입자를 제거합니다. 그런 다음 큐벳에 샘플의 50-100 마이크로 리터를 채우고 750-1, 000 마이크로 리터의 여과된 탈이온수로 묽게 합니다.
큐벳을 DLS 기기에 삽입하려면 샘플 컴파트먼트 커버를 열고 큐벳의 상단 가장자리를 잡고 광학 창에 지문이 남지 않도록 합니다. 큐벳을 기기의 광학 경로에 적절하게 정렬하여 놓습니다. 그런 다음 시료 격실을 닫아 주변광을 차단합니다.
DLS 기계에서 관련 소프트웨어를 사용하여 입자 크기 측정을 시작합니다. 측정 후 Z 평균, 평균 PI, 분당 카운트 속도, 제타 전위 및 관련 그래픽을 포함하여 샘플과 관련된 결과를 선택합니다. correlation 함수가 균일한 표본을 나타내는 부드러운 시그모이드 곡선을 표시하는지 확인합니다.
분석이 완료되면 DLS 기기에서 큐벳을 조심스럽게 제거합니다. BSA 단백질과 관련된 피크의 강도가 점진적으로 감소하는 것이 관찰되었으며, 이는 나노겔 구조 내에서 단백질의 캡슐화를 시사합니다. Cy7 태그가 부착된 BSA 로딩 나노겔의 물리적 화학적 특성은 50-100나노미터에서 단일 정의된 피크를 보여주었습니다.
그러나 빈 나노겔은 일관되지 않고 더 큰 크기를 보여주었습니다. 캡슐화된 Cy7 태그 BSA의 최대 86%가 48시간 이내에 방출되었습니다. 반면에, 글루타치온을 첨가하지 않은 대조군 실험에서는 단백질이 15%만 방출되었습니다.
푸리에 변환 적외선 분석은 나노겔 합성 및 글루타티온 배양 후 동안 분리 된 BSA가 구조를 유지했으며, 이는 손상되지 않은 베타 회전을 나타내는 1, 662 센티미터 역의 피크로 표시되었습니다. 그러나 30일 동안 보관된 나노겔의 BSA는 1, 613cm 역에서 피크를 보였는데, 이는 분자 간 베타 시트 구조 및 단백질 응집을 나타냅니다. 원형 이색성은 네이티브 BSA와 같은 변경되지 않은 스펙트럼을 보여주었으며, 이는 보존된 알파 나선 구조를 나타냅니다.
그러나 30일 후에 분리된 BSA의 특성 피크에서 약간의 수차는 일부 응집을 시사했습니다. 지속적인 질소 흐름을 유지하는 것은 산소가 자유 라디칼 중합을 억제하는 것을 방지하는 데 중요합니다. 또한 성공적인 합성을 위해 초기 시스템 구성 요소를 신속하게 추가해야 합니다.
이 절차 후, 생리학적 환원제인 글루타티온(glutathione)으로 배양하여 DLS, TEM 및 산화 환원 반응성 평가를 통해 나노겔 크기의 분포, 형태 및 페이로드 방출 역학을 추가로 특성화할 수 있습니다.
