뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

이 기술은 뇌 조직 절편에서 미엘린을 이미지화할 수 있습니다. 수초화는 활동 전위의 전도에 중요한 역할을 하며 미엘린을 이해하면 뇌 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어 전자 현미경에 비해 CARS 기술의 주요 이점은 CARS가 광학 현미경 기술이고 면역조직화학에 사용되는 것과 같은 다른 형광 영상과 용이하게 조합될 수 있다는 것입니다.

여러 의학적 상태는 수초화의 변화, 예를 들어 다발성 경화증, 노화 및 자폐증으로 인한 것입니다. 이러한 변화를 이해하면 근본적인 의학적 상태를 이해하는 데 도움이됩니다. 이 경우 CARS 레이저는 이미지 지질 또는 특히 CH2 결합에 맞게 조정됩니다.

뇌에서 지질의 가장 큰 원천은 수초입니다. 따라서 이것은 뇌 조직에서 미엘린을 이미지화하는 기술입니다. 지질을 이미징하는 것이 관심이있을 때 다른 유형의 조직에 대해 동일한 방법을 사용할 수 있어야합니다.

CARS 레이저를 튜닝하고 정렬하려면 상당한 전문 지식이 필요하며 레이저 또는 광학 현미경 전문가가 수행하는 것이 가장 좋습니다. 원고에 기재된 대로 조직을 준비한 후, 세포체를 시각화하기 위해 니젤 및 항체 배지에 대한 얼룩이 없는 부유 절편을 배양한 다음, 표준 실험실 쉐이커에서 실온에서 30분 동안 배양한다. 샘플을 현미경으로 가져 오기 전에 CARS 레이저를 켜고 최소 1 시간 동안 예열 한 다음 펌프와 스톡스 레이저 빔을 공간적으로 겹쳐서 CARS 레이저를 정렬하고 두 레이저 빔 사이의 지연을 조정합니다.

전방 CARS 이미징을 위해 콘덴서 광학 장치와 현미경의 다이어프램을 채색 한 다음 외부 잠망경을 조정하여 공간적으로 겹쳐진 두 개의 레이저를 현미경의 스캐닝 헤드 미러에 중앙에 놓습니다. 최상의 전방 CARS 비스캔 감지를 위해. 콘덴서가 유인되었는지 확인하십시오.

면역형광, 컨포칼 이미징 및 자동차 이미징의 경우 형광 이미징을 위한 가시광선 레이저가 장착된 컨포칼 현미경을 통합하여 CARS 레이저를 전방 및 에피 CARS 비스캔 검출기에 장착합니다. 이제 덮개 슬립 바닥이 있는 배양 접시에 섹션을 놓고 조직이 건조되지 않도록 PBS를 놓습니다. 또한 유리 추를 사용하여 티슈를 커버 슬립 근처에 두십시오.

그래픽 사용자 인터페이스를 사용하여 자동차 및 미사일 형광 컨포칼 이미징에 대한 이미지 획득 파라미터를 설정합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 샘플에 초점을 맞추고 이미지를 캡처합니다. CARS의 스펙트럼 범위는 640에서 660 나노 미터이며 nisel-tagged 면역 형광 마커와 스펙트럼이 겹치지 않는 것으로 보이며, 이는 CARS 신호가 면역 형광 신호와 함께 사용될 수 있음을 나타냅니다.

Nisel은 몽골 저빌과 마우스 뇌의 세포체를 시각화하는 데 사용되었으며 CARS의 이미징은 수초를 시각화하는 데 사용되어 이 기술이 여러 종에 걸쳐 사용될 수 있음을 나타냅니다. 두 이미지 세트 모두 뇌간에서 사다리꼴 몸체의 내측 핵 부분을 보여줍니다. CARS의 해상도는 전자 현미경보다 낮으며 수백 나노 미터 정도입니다.

이미지는 ImageJ와 같은 표준 이미지 분석 소프트웨어로 분석하여 관심 파라미터(예: 미엘린 두께 또는 길이)를 정량화할 수 있습니다.