이 프로토콜은 생쥐가 자발적인 발작을 일으킨 측두엽 간질에 대한 새로운 모델을 생성하며, 간질 발생 메커니즘을 조사하고 새로운 치료법을 스크리닝하는 데 매우 유용했습니다. VGAT-Cre 마우스에서 이 절차는 화학 경련제 또는 지속적인 전기 자극으로 유발된 상태 간질 후에 종종 나타나는 광범위한 해마 세포 사멸을 일으키지 않고 자발적으로 반복되는 전기 및 운동 및 운동 복합 발작을 안정적으로 유도합니다. 헤드셋 제작을 시작하려면 3.5cm 길이의 폴리테트라플루오로에틸렌 코팅 스테인리스 스틸 와이어를 자르고 와이어 양쪽 끝에서 절연 코팅을 약 1mm 벗겨냅니다.
바이스 홀더에 두 개의 핀을 놓고 핀의 바닥 부분이 아래를 향하도록 합니다. 그런 다음 와이어의 벗겨진 끝과 핀 상단에 플럭스를 적용합니다. 와이어의 벗겨진 부분과 핀 상단을 측면에 넘치지 않고 코팅할 수 있을 만큼만 땜납으로 주석 처리합니다.
땜납이 녹는 동안 와이어의 벗겨진 끝 중 하나를 가능한 한 깊게 핀에 넣습니다. 와이어의 다른 쪽 끝을 벗겨낸 상태에서 두 번째 핀에 대해 이 과정을 반복합니다. 핀과 땜납을 10초 동안 식힌 후 바이스 홀더에서 핀을 제거한 다음 핀을 당겨 와이어와 핀 사이의 연결이 강하고 고정되는지 확인합니다.
찬물에 핀을 헹구고 말리십시오. 나중에 저항계를 사용하여 핀 1과 핀 2 사이의 컨덕턴스를 확인합니다. 와이어 끝에 있는 핀을 함께 가져와 평행하게 고정하고 닫습니다.
Clamp 지혈제를 와이어 중앙에 대고 지혈기를 회전시켜 와이어를 단단히 비틀어 줍니다. 지혈제를 제거한 후 집게를 핀 아래 2mm의 꼬인 와이어에 고정하여 와이어를 90도 구부립니다. 와이어를 집게 위로 90도 뒤로 밀어 첫 번째에서 1mm에 한 번 더 구부립니다.
작고 날카로운 가위를 사용하여 꼬인 와이어를 굽힘 아래 45도 및 3.5mm에서 자릅니다. 각 헤드셋에 대해 두 개의 바이폴라 또는 이중 핀 꼬인 전극을 준비합니다. 하나의 기준 전극을 준비하려면 양쪽 끝에 납땜된 핀이 있는 와이어를 두 개로 자릅니다.
그런 다음 와이어를 7mm로 자르고 팁 아래 1mm에서 와이어 끝을 구부립니다. 구부러진 와이어의 1mm 끝을 집게로 덮고 집게 주위로 와이어를 단단히 돌려 직경 1mm의 작은 고리를 만듭니다. 그런 다음 와이어의 직선 부분에 수직으로 루프를 구부려 와이어 팁이 다시 바깥쪽을 향하도록 합니다.
모든 전극을 두 양극 전극 사이에 6mm 거리를 두고 6핀 받침대에 나란히 조립합니다. 중간 외부 구멍에 기준 전극을 놓습니다. 수술을 진행하기 전에 8주령 VGAT-Cre 마우스의 체중을 기록합니다.
그런 다음 동물을 유도 챔버에 넣어 마취를 유도합니다. 마취된 마우스를 섭씨 37도의 가열 패드에 놓습니다. 피드백 제어 온도 시스템을 사용하는 경우 수술 중 온도 모니터링을 위해 온도 프로브를 동물의 직장에 삽입하십시오.
수술을 시작하려면 흡입 마취 흐름을 코 콘으로 방향을 바꾸고 앞니를 앞니 막대에 부드럽게 넣고 원뿔을 코로 움직여 동물을 정위 프레임에 장착하십시오. 그런 다음 이어 바를 귀에 넣고 정위 프레임에 부착하십시오. 동물의 머리가 수평을 이루고 중앙에 있는지 확인하고 약간 조사할 때 움직일 수 없는지 확인하십시오.
동물이 장착되면 수분 공급을 위해 0.5 밀리리터의 노르 모솔을 생쥐에 주입하고 각막 건조를 방지하기 위해 안구 윤활제를 바르십시오. 뒷다리 발을 꼬집어 마취의 깊이를 모니터링하십시오. 동물에 금단 반사가 없으면 수술 부위 주변의 마우스의 두피 모발을 제거하십시오.
완료되면 에탄올과 요오드를 번갈아 가며 깨끗한 피부 부위를 세 번 소독하고 요오드로 마무리하고 0.05 밀리리터의 0.25 % 부피 바카인을 피하 주사합니다. 메스를 사용하여 두개골을 절개 한 다음 수술 용 가위로 피부 일부를 잘라내어 두개골을 노출시킵니다. 면봉으로 모든 밑에있는 조직에서 두개골을 청소하기 전에 피부를 옆으로 밉니다.
멸균 면봉을 사용하여 과산화수소로 두개골을 청소하고 두개골 봉합사, 브레그마 및 람다를 볼 수 있도록 합니다. 정밀하게 장착된 드릴을 사용하여 드릴 팁을 X, Y, Z 좌표가 0인 브레그마로 이동합니다. 그런 다음 드릴을 올리고 람다로 이동하여 좌표를 결정하여 헤드가 수평인지 확인합니다.
두개골을 완전히 건조시킨 후 어플리케이터로 자체 에칭 치과용 접착제 한 방울을 바릅니다. 치과용 UV 광선으로 치과용 접착제를 40초 동안 경화시키기 전에 60초 동안 기다리십시오. 광택 표면은 접착제가 두개골과 효과적으로 가교되었음을 나타냅니다.
0.031 인치 드릴 비트를 사용하여 분당 5, 000 회전 또는 RPM으로 두개골에 두 개의 버 구멍을 조심스럽게 뚫어 뇌에 구멍을 뚫지 않도록합니다. 버 구멍의 드릴링을 향상시키기 위해 식염수 한 방울을 바르십시오. 해마 깊이 전극을 이식하려면 브레그마에서 뒤쪽 3mm, 측면 3mm로 뚫습니다.
람다 뒤의 소뇌 위에 기준 전극을 위한 버 구멍 하나를 브레그마에서 뒤쪽 6mm, 측면 0mm에 뚫습니다. 다음으로, 조립된 전극이 있는 6핀 받침대를 스테레오탁스 프레임의 전극 홀더에 장착합니다. 전극을 해당 버 구멍 위에 정렬하여 헤드셋을 천천히 내리고 탐색하여 왼쪽 및 오른쪽 해마 버 구멍 바로 위에 있는 두 개의 양극 전극 팁을 찾고 필요한 경우 기준 전극을 조정하여 소뇌 위의 구멍 위로 마우스를 가져갑니다.
해마 트위스트 전극이 구멍 바로 위에 있을 때 Z축을 0으로 하고 전극을 오른쪽과 왼쪽 해마로 마이너스 3mm까지 천천히 낮추고 기준 전극을 소뇌 위의 구멍으로 안내합니다. 믹싱볼에 분말과 액체를 혼합하여 치과용 시멘트를 제조하였다. 그런 다음 두개골 표면, 전극 및 두개골 표면과 받침대 바닥 사이의 공간을 치과용 시멘트로 덮습니다.
시멘트가 마르고 굳어지면 전극 홀더를 정위 암에서 분리하고 암을 들어 올려 받침대에서 홀더를 제거합니다. 마우스를 케토프로펜과 노르모솔로 피하 투여한 후, 동물을 정위 프레임에서 제거하여 동물을 동물 사육장 케이지의 가열 패드로 옮깁니다. 완전히 깨어나면 한 마리의 동물을 동물 사육장으로 돌려보내고 동물에게 부드러운 음식을 먹이고 수술 후 최대 72시간 동안 매일 체중 감소를 모니터링합니다.
대표적인 바이올린 플롯에는 점화 상태 기준에 따라 마우스가 요구하는 자극의 수가 표시됩니다. 마우스는 일반적으로 점화 상태에 도달하거나 15번의 자극 후에 5번의 양측 긴장 간대 운동 발작을 경험합니다. 자발성 재발 발작(SRS)까지의 잠복기는 10.7로 나타났고, 발작의 평균 빈도는 하루 1.3회였다.
신뢰할 수 있는 SRS 분포는 마우스가 대략 23일 동안 간질이었다는 것을 보여주었다. 대표 이미지에서 해마와 내후각 피질의 다양한 하위 필드에서 항-NeuN 양성 뉴런 또는 뉴런 사멸의 수를 볼 수 있습니다. 두 개의 바이폴라 전극이 두 개의 버 구멍에 부드럽게 들어가도록 하는 것이 중요하므로 버 구멍 바로 위에 있어야 합니다.
또한 전극 홀더를 제거하기 전에 치과용 시멘트를 조심스럽게 도포하고 완전히 굳히는 것이 중요합니다. 이 기술을 사용하면 간질 마우스를 생성하고 EEG 기록과 비디오 녹화를 동시에 통해 지속적으로 모니터링 할 수 있습니다. 그리고 우리가하는 실험을 통해 발작의 빈도, 기간 및 중증도를 줄이기 위해 유전자 치료와 같은 새로운 치료법 전략을 테스트 할 수 있습니다.
