우리는 절제된 두뇌 수술에 제출된 살아있는 인간 기증자에게서 집합된 두뇌 조직에서 자유로운 떠있는 슬라이스 문화를 준비하는 프로토콜을 제시합니다. 이 배양은 생화학 및 세포 생물학 분석 또는 면역 히스토케를 수행 할 수 있습니다. 그것은 관련 된 뇌 질환에 신경 변성의 기본 메커니즘의 해명에 기여할 것으로 예상 된다.
이 기술의 주요 장점은 멤브레인 삽입을 사용하여 고전적인 슬라이스 배양 프로토콜에 대한 보다 간단하고 비용 효율적인 대안이라는 것입니다. 전반적인 프로토콜은 복잡하지 않지만, 수막 제거, 진동편 디스크에 조직을 접착, 면역조직화학에 대한 절제 와 같은 몇 가지 단계는 시각적으로 입증될 때 가장 잘 이해된다. 이 절차를 시연하는 데 도움이 되는 것은 졸업생인 닐 멘데스와 글라우샤 알메디아, 또 다른 졸업생인 조반나 노게이라입니다.
이 절차를 시작하려면 얼음 양동이에 소금을 추가합니다. 슬라이스 용액을 이 양동이로 옮기고 사용 전에 적어도 20분 동안 카보겐 혼합물버블링 아래에 놓아 둡니다. 다음으로, 2센티미터x2센티미터에 달하는 3%의 아가로즈 블록을 준비한다.
수퍼 접착제아가로스 블록을 진동기시편 디스크에 접착제로 하여 슬라이스 하는 동안 조직 샘플에 추가 기계적 지원을 생성한다. 진동에서 단면 두께를 200 마이크로미터로 설정하고 진동 주파수를 100 헤르츠로 설정하고 초당 0.5 ~1.0밀리미터 사이의 슬라이스 속도를 선택합니다. 그런 다음 진동 용액과 시료를 받기 전에 및 슬라이스 절차 전반에 걸쳐 냉장 보관하기 위해 진동 완충 트레이를 진동 베이스에 잠그고 얼음을 추가합니다.
먼저, 수송시 시 시냉각을 위한 수송용 용액및 얼음을 포함하는 수송용기 및 수송용기에 가스 출력을 연결하는 실리콘 튜브에 연결된 가스 출력을 제어하는 압력 플럭스 밸브에 연결된 카보겐 혼합물을 포함하는 휴대용 가스 실린더로 구성된 운송 장치를 설치한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표본및 전송을 수집하고 전송합니다. 시편을 슬라이스 용액이 함유된 페트리 접시로 옮기습니다.
미세 한 수술 도구를 사용 하 여, 신중 하 게 가능한 한 나머지 수막의 많은 제거. 실험 설계의 특정 특성을 가진 슬라이스를 생산하기위한 최고의 표본 방향을 선택하고 표본 디스크에 접착 될 베이스로 평평한 표면을 트리밍하는 숫자 24 메스 블레이드를 사용합니다. 폐기 플라스틱 숟가락과 섬세한 페인트 브러시를 사용하여 페트리 접시에서 조각을 수집하고 필터 용지로 과도한 용액을 건조시십시오.
다음으로, 슈퍼 접착제를 사용하여 접시에 단단히 부착되고 아가로즈 블록과 접촉할 때까지 진동편 접시에 조직을 부착합니다. 진동성 시편 디스크를 진동 완충 트레이에 넣습니다. 면도날을 단단히 고정한 칼 홀더를 제자리에 고정시하십시오.
슬라이스 용액을 추가하고 시편과 블레이드를 모두 덮고 있는지 확인합니다. 그런 다음 표본을 200 마이크로미터 슬라이스로 자르기 시작합니다. 버퍼 트레이에서 슬라이스용 슬라이스가 포함된 페트리 접시에 옮기고 느슨한 모서리와 과도한 흰색 물질을 약 70%의 피질과 30%의 흰색 물질로 다듬습니다.
라미나르 유량 캐비닛에는 24웰 플레이트의 각 웰에 600 마이크로리터의 배양 배지를 추가하고 슬라이스를 도금하기 전에 최소 20분 동안 5%의 이산화탄소를 36도에 배양합니다. 그 후 페인트 브러시를 사용하여 각 우물에 한 조각을 플레이트합니다. 접시에 사용하지 않은 우물이 있으면 멸균 수400 마이크로리터로 채웁니다.
이산화탄소 5%와 섭씨 36도에서 배양합니다. 보충 10 밀리 리터의 이전에 준비 된 배양 매체의 밀리 리터 뇌 파생 된 neurotrophic 요인의 농도50 밀리 리터 당 나노 그램. 8~16시간 후, 각 우물에서 조건부 배지의 마이크로리터 333개를 제거하고 신선한 BDNF 보충 배지 133마이크로리터를 추가합니다.
24시간마다 조건부 배지의 3분의 1을 신선한 BDNF 보충 배지로 교체하십시오. 먼저 배양 매체를 포함하는 우물에서 PBS를 포함하는 새로운 24웰 플레이트로 슬라이스를 옮는다. 각 우물에서 PBS를 제거하고 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터로 대체합니다.
섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 다음 날, 조심스럽게 우물에서 파라 포름 알데히드를 제거하고 30 %의 자당 용액의 1 밀리리터로 대체. 48시간 동안 섭씨 4도에서 배양하세요.
48 시간 후, 마이너스 섭씨 40도에 동결 마이크로 토메를 설정합니다. 슬라이스를 배치해야 하는 마이크로톤 스테이지에서 자당베이스를 준비합니다. 완전히 고정된 후, 냉동 자당 중 일부를 잘라 슬라이스가 배치되는 평평한 표면을 생성합니다.
다음으로 각 조각을 늘어난 플라스틱 필름 위에 놓고 페인트 브러시를 사용하여 조직을 평평하게 합니다. 한 번의 이동으로 늘어난 슬라이스를 얼어 붙은 자당 베이스로 옮길 수 있습니다. 슬라이스가 제대로 얼어 붙은 지 5~10분 간 휴식을 취하면 슬라이스를 30마이크로미터 섹션으로 자른다.
30 마이크로미터 섹션을 PBS가 함유된 페트리 접시로 옮기고 실험 설계에 적합한 조직학 프로토콜로 진행한다. 배양 된 조각의 품질과 건강을 결정할 때, 평가하는 중요한 측면은 예상 신경 세포 유형, 뉴런 및 신경교 세포의 존재와 전형적인 형태입니다. 인간 피질 적층의 전형적인 아키텍처는 신경 면역 라벨링에 의해 드러난 체외 4에서 하루 에 슬라이스에서 관찰된다.
또한, 마이크로글리아와 천체글리아의 예상 존재도 관찰된다. 이러한 결과는 조직 아키텍처가 외과 적 시술, 샘플 처리 또는 시험관 내단기 기간에 의해 크게 영향을받지 않는다는 것을 보여줍니다. 염화칼륨에 대한 신경 반응은 또한 ERK 인산화를 따라 배양된 슬라이스에서 정량화되었다.
흥미롭게도, ERK 인산화의 명확한 증가는 체외 4에서 날염화 처리 된 칼륨에서 볼 수 있습니다. 마지막으로, 체외 4에서 슬라이스의 반응은 과산화수소수소를 유도하는 알려진 산화 스트레스로 평가된다. 슬라이스를 과산화수소 300밀리머에 24시간 동안 노출하면 MTT 감소가 크게 감소했습니다.
종합하면, 과산화수소 도전 후 체외5슬라이스에서 관찰된 대규모 세포사멸과 염화칼륨 유발 탈극성 결과 산화 스트레스와 같은 독성 자극에 반응하는 체외 4에서 슬라이스의 보존된 일반 건강을 나타낸다. 이 프로토콜은 주로 후보 약물에 의한 신경 독성 및 신경 보호의 분자 메커니즘의 조사와 같은 1 주일 이상 지속되는 분석서에 기초한 연구에 전념합니다. 이 프로토콜은 미세 저항측두엽 간질을 위한 외과 치료에 제출된 환자에게서 집합된 피질 조직을 사용하는 데 전념하고 있더라도, 그밖 두뇌 지구 또는 조건에서 집합된 조직은 또한 자유 부동 슬라이스 문화를 생성하는 근원일 수 있었다는 것을 확률이 높습니다.
성인 인간의 뇌에서 슬라이스 배양 설치류 두뇌에서 생산 하는 조각에 부족 한 그들의 독특한 세포 회로 와 분자 기계 때문에 인간의 신경 병 증의 우리의 이해를 발전에 중요 한 수 있습니다.
