1. Micropatterns에 세포 준비 및 심는 <ol><li> 플레이스 6 잘 접시 2 독립 웰스 2 CYTOOchips 당신이 CYTOOchip의 오른쪽 하단 모서리에있는 &#39;CYTOO &quot;를 읽어 있도록. Micropatterns는 찬란 Cy3 또는 Cy5 염료로 분류하실 수 있습니다. 본 실험에 사용 CYTOOChips은 Cy3 찬란 micropatterns를 분류했습니다. 주의 : 어둠 속에 칩을 보관하십시오. </li><li> trypsinization로 헬라 세포를 (~ 80 %의 합류)를 수집합니다. 세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분산되는 현미경으로 확인합니다. 4 분에 대한 300g에 세포를 수집하고 원심 분리기, 부드럽게 세포 펠렛을 resuspend. 세포를 카운트하고 15,000 세포 / 완료 DMEM/F12 문화 매체 ML의 농도로 희석. </li><li> 잘 CYTOOchip을 포함하는 각각에 4 ML (60,000 셀)을 분배. 주의 : 접시는이 센터에서 세포를 집중하는 경향이 있으므로 중간에 회전 움직임을 유도 피하기 위해 가능한 한 작은으로 이동해야합니다. </li><li> 후드 아래에 10 분에 대한 세포의 침전물은 다음 세포 배양기로 움직여. 10-20 분 후, 세포가 micropatterns을 준수하기 시작합니다. 10 분 후, 현미경으로 정기적으로 확인하십시오. </li><li> 최대한 빨리 세포가 첨부로 세포 매체를 변경하고 부드럽게 다음 절차를 사용하여 coverslip 표면을 플러시 : </li><li> 접시 평면 유지하는 것은, 부드럽게 잘의 측면에서 피펫으로 매체를 대기음. 주의 : 칩 건조 사라지게하지 않을,이 모든 액체를 대기음 없지만 항상 CYTOOchip을 감추기에 충분 할만큼 떠나지 않을 것을 의미합니다. </li><li> 4 ML PBS를 추가하고 처음엔 잘 측면으로 이동 칩의 중심에서 시작 다시 대기음. 공기에 칩을 노출하지 않고 설명으로 PBS를 대기음. 3-4 회 반복합니다. </li><li> 부유 세포에 대한 현미경 검사 : <ul><li> 부동 세포의 다수가 남아있는 경우, 세탁 절차를 반복합니다. </li><li> 당신은 거의 세포를 볼 경우, PBS의 일부를 대기음 2 ML 신선한 매체로 바꾸십시오. 기음과 두 번 신선한 중간 4 ML를 추가합니다. </li></ul></li><li> ° C 3 시간 최소 5 % CO 2 세포가 확산 전체를 달성하기위한 수 있도록 37 조직 문화의 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 참고 : micropatterns가 하나 또는 여러 개의 셀을 차지하는 것입니다 10~30% (2000-6500) 사이에이 방법을 사용합니다. 주의 : 세포 세탁 단계와 micropatterns에 대한 세포의 확산 것은 각각의 세포 라인에 특정 것입니다 전체에 필요한 시간 전에 준수해야하는 데 필요한 시간. </li></ol> 2. Blebbistatin 트리 트먼트 <ol><li> 17 mm의 주식 솔루션을 얻기 위해 100 % DMSO에 blebbistatin를 해산. 100 % DMSO 5 mm까지 추가로 주식 솔루션을 희석. 0.1 % DMSO에 5 μm의의 blebbistatin의 최종 농도를 얻을 문화 매체의 최종 희석하십시오. </li><li> 제어 조건, 단 0.1 %의 DMSO를 포함하는 중간 4 ML을 준비합니다. </li><li> 세포에있는 미디어를 기음과 치료 및 제어 조건 준비 4 ML 매체로 바꾸십시오. </li><li> 37 1 시간에 대한 품어 세포 ° C. </li></ol> 3. 세포 고정과 굴지의 스테 이닝 <ol><li> 세포 고정을위한 솔루션 준비 cytoskeleton 버퍼 (CB) 및 PFA 5 % 준비를위한 시약 섹션을 참조하십시오. CB는 특히 굴지의 필라멘트와 microtubules의 형광 라벨을 권장합니다. <ul><li> 1xCB - 자당 준비 : CB 2 ML에 자당의 1g을 추가합니다. 자당의 포함은 내부 세포 구조를 유지하는 데 도움이됩니다. </li><li> PFA - CB - 자당 4 % 준비 : 따뜻한 PFA 5 % 4 ML에 1xCB - 자당 1 ML을 추가합니다. 주의 :이 솔루션은 4 ° C 단 몇 일 동안 보관하실 수 있습니다. </li></ul></li><li> PFA의 고정 <ul><li> 4퍼센트 PFA - CB - 자당 솔루션 2 ML을 포함하는 6 자 판의 우물 (세탁 제외) CYTOO 로고와 장소를에 CYTOOchip 데리러 포셉를 사용하여 </li><li> RT 10 분 알을 품다 </li><li> PFA - CB - 자당을 제거하고 PBS로 한번 씻어 </li><li> 잔여 PFA의 crosslinking 활동을 담금질하기 위해 10 분 100 MM NH 4 Club 호텔 2 ML과 함께 두 번째 세척을 참고 : PFA 고정 슬라이드가 4 며칠 ° 형광 이미징을위한 organelle의 얼룩하기 전에 C에 대한 PBS에 저장할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 트리톤 X - 100 세포막의 Permeabilization 세제로 세포의 Permeabilization는 항체 또는 기타 프로브는 세포막에 침투 수 있으며 그렇지 않으면 어려운 자신의 로컬 리 제이션을 분석할 수 있도록 cytoskeletal 폴리머의 대비를 줄일 수 cytoskeleton의 단백질의 cytosolic 수영장의 일부를 제거합니다. <ul><li> RT 3 분 NH 4 Club 호텔을 제거 2 ML 추가 / 우물의 0.1 % 트리톤 X - 100 - CB </li><li> 2 ML PBS로 두 번 씻어 </li></ul></li><li> 굴지의 얼룩 형광 - phalloidin있는H는 기본 굴지에 바인딩은 굴지의 필라멘트를 얼룩하는 데 사용됩니다. <ul><li> 1.5 % BSA와 PBS에서 1:2000 희석 FITC - 복합 phalloidin 2 ML 추가 </li><li> RT에서 품어 1 H </li><li> 2 ML PBS로 한번 씻어 </li></ul></li><li> 핵의 얼룩 <ul><li> (PBS에 1μg / ML로 얼룩) Hoechst 2 ML 추가 </li><li> RT 3 분 알을 품다 </li><li> 2 ML PBS로 2 번 씻어 </li></ul></li><li> 슬라이드 마운트 <ul><li> 25-30 Mowiol의 μL 또는 기타 장착 솔루션을 사용하여 표준 현미경 슬라이드에 CYTOO 로고와 마운트 CYTOOchip에 CYTOOchips를 선택하십시오. </li></ul></li></ol> 4. 현미경의 설치 및 자동 이미지 수집 많은 이미징 소프트웨어 패키지는 제어 빠른 자동 이미지 수집 및 표시에 대한 현미경 존재합니다. 이 예제는 Metamorph 이미징 소프트웨어와 자동 인수는 CCD 카메라와 하마 마츠 Intensilight 수은 섬유 조명기 장착된 니콘 이클립스 티 현미경에서 수행을 사용합니다. 이미지 DAPI (핵), 싸이 - 3 (micropatterns)와 FITC - Phalloidin (굴지)에 해당하는 세 파장의 20x 확대에 인수됩니다. micropatterns의 숫자는 카메라와 목표의 설정에 따라 달라집니다 분야마다 시각. CYTOO의 micropatterns 크게 인수를 촉진 칩 전체 (100 또는 130 μm의) 서로 정의된 간격으로 위치하고 있습니다. <ol><li> 20x 확대를 선택합니다 </li><li> 오픈 다차원 수집 (메뉴 막대에 : 애플 리케이션 / 다차원 취득)과 실험의 다양한 매개 변수를 설정 : <ul><li> 파장 수 : 3 </li><li> 파장 유형 : DAPI, FITC, Cy3 </li><li> 최초의 세포의 분야에 초점을하여 각 파장에 대한 노출 시간을 설정 </li><li> 자동 초점은 각 파장에서 수행할 수 </li><li> 데이터를 저장할 위치를 선택하십시오 </li></ul></li><li> 12 micropatterns는 시각과 카메라 분야 (4 열 및 패턴 3 행) 중심으로 수 있도록 Cy3 파장과 위치 카메라를 선택합니다. </li><li> 다차원 취득을 실행하는 일기를 만듭니다. 일기 작성을위한 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. </li><li> 오픈 스캔 단계 기능 (메뉴 막대에 : 장비 / 무대 / 스캔 스테이지). 20x 확대 24 이미지가 포함된 각 12 micropatterns를 얻기위한, -400 μm의 X 단계의 크기 300 μm의의 Y 단계 크기, 6 열 4 행을 입력합니다. 실행으로 설정 저널에서 저널 MDA.JNL을 업로드할 수 있습니다. 다음 세 가지 파장의 전체 블록의 자동 수집을 시작하는 스캔을 누르십시오. 참고 : 단계 크기는 여기에 표시된 X와 Y가 카메라 분야에서 현재 micropatterns의 개수에 따라 달라집니다. 올바른 방향으로 운동에 대한 부정적인 가치를 요구할 수 있습니다 당신의 단계에 따라이 X 및 / 또는 Y에서 방향을 설정합니다. </li></ol> 5. 자동 이미지 처리 및 분석 많은 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 패키지는 존재합니다. 절차는 아래 개요 이미지 프로세싱과 오픈 소스 프로그램 ImageJ용으로 작성된 사용자 지정이 만든 매크로가 수행 분석 단계를 설명했다. 첫 번째 매크로 CellRef가 참조 셀, 세포막의 두 번째 Hypotenuse 대책 강성 / 축소를 만듭니다. 모두를 통해 요청할 수 있습니다 <a href="www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> micropatterns (매크로 CellRef)을 중심으로 세 가지 채널에 대한 이미지 스택을 만듭니다. micropatterns의 이용은 크게 현지화 및 개별 세포의 세분화는 자동 영상 처리의 첫 단계를 단순화, 셀 클러스터링 및 clumping을 방지합니다. 찬란 표시 micropattern 이미지는 micropatterns을 중심으로 지역을 정의하고 구분하는 데 사용됩니다. 이 지역은 다음 다른 채널에서 가져온 이미지로 바뀜과 먹죠. 해당 자른 이미지는 다음 각 파장에 대해 스택에 조립합니다. RGB - 스택은 또한 세 가지 채널 (그림 2)의 병합에서 만들어집니다. </li><li> 하나의 셀 선택 필터 (매크로 CellRef)을 적용 위의 지적으로 남은 micropatterns가 비어있는 동안, micropatterns의 10-30% (2000-6500)는, 단일 셀 또는 여러 세포에 의해 점유하고 있습니다. 단 하나의 세포에 의해 점유 micropatterns을 표시 이미지를 선택하려면, 매크로 이미지마다 핵의 숫자를 감지하여 모든 스택 (RGB하고 다른 파장)를 포함 하나 이상의 핵 또는 전혀 핵 (그림 3)에서 제거합니다. </li><li> 정규화되지 않은 완전히 셀 영역 컷을 해제 사용하는 필터 (매크로 CellRef) micropattern 가로질러 뻗어되지 않습니다 세포 제거 하려면 핵 필터를 탈출했을 세포, 굴지에 대한 FITC 채널을 사용하여 다른 필터를 분리 제거가 적용됩니다. 셀 영역은 계산하고 특정 컷 오프 (이하 계면 셀 면적보다 2 배에 대한 세포 분야) 아래 그 모든 스택에서 제거됩니다. 셀 봉투 영역은 패턴의 크기에 의해 결정됩니다. </li><li&gt; (매크로 CellRef) 셀 이미지 정렬 이전 단계에서 단일 micropatterned 세포를 포함하는 이미지가 선택되었습니다. 이러한 이미지가 micropatterns 중심으로에도 불구하고, 그들 모두는 완벽하게 서로 정렬 적이 없습니다. 이미지 처리, ImageJ 플러그인 (MultiStackReg)를 체결하려면 micropattern 위치를 기반으로 모든 수집된 이미지와 모든 채널을 재개하는 적용됩니다. 이 단계는 이제 참조 세포의 단일 세포 분석 또는 작성 (그림 4)에 사용할 수있는 개별 이미지의 정렬 스택을 생성 </li><li> 참조 셀 (매크로 CellRef)를 구축 micropatterns에 성장하는 세포는 모든 세포와 비슷한 모양을 가지고 것을 의미합니다. 이 정규화는 여러 셀 이미지의 정확한 정렬 및 오버레이를 허용합니다. 전체 스택이 지남에 따라 각 이미지의 신호를 합산하면 하나가 &quot;에 관한 약물 효과&quot;를 시각화하고 평가할 수 있습니다. 최종 전체 이미지 또는 참조 셀은 표현과 이미지 분석을위한 독특하고 유용한 도구입니다 단 micropatterned 세포 (그림 4)로 구할 수 있습니다. ImageJ에서 참조 전지는 스택에서 필터링 및 정렬 이미지의 투영함으로써 구성되어 있습니다 (이미지&gt; 스택스&gt; Z - 프로젝트). 몇 가지 프로젝션 방법은 같은 평균이나 최대 강도로 적용할 수 있지만 일반적으로 중간 프로젝션은 이미지 스택의 주요 outliers을 제거하는 선택됩니다. 결과 심사를 촉진하기 위해 색상 코드 주파수지도로 monocolor 이미지를 변환 LUT는 (테이블을 조회) 적용됩니다. </li><li> 관심의 매개 변수 (매크로 Hypotenuse)를 측정하고 quantifying 양식이 하나의 주요 스트레스 섬유에 굴지의 cytoskeleton를 실시하고 있기 때문에이 비디오 문서에서는 L - micropatterns이 사용됩니다. 이런 방식으로 굴지 강조함으로써, cytoskeleton에 blebbistatin의 영향은 여러 가지 방법으로 확인할 수 : 또는 스트레스 섬유의 강도, 길이 또는 두께 얼룩 굴지 스트레스 섬유의 굴절률이 변화하고, 굴지의 필라멘트의 morphometric 기능의 변화를 측정 셀 모양 등은 이러한 매개 변수는 개별 셀 이미지 또는 최종 참조 셀 자체에 어느 측정할 수 있습니다. 여기, 5 μm의 제품 blebbistatin의 영향은 두 번째 ImageJ 매크로 (그림 7) Hypotenuse라는 이름을 사용하여 붕괴 세포의 수를 세어 특징했다. 간단히, L - micropattern의 thresholded 이미지는 셀 삼각형 모양의 이론적 hypotenuse을 정의하는 데 사용됩니다. 다음 굴지의 스테인드 이미지 thresholding는 대략적인 실제 셀 모양을 위해 수행됩니다. 세포 삼각형과 실제 오목 세포막의 이론 hypotenuse 사이의 영역은 다음 측정됩니다. 세포가 붕괴되면, 이론적 hypotenuse 아래 영역이 나타납니다. 붕괴 세포의 비율 제어를 비교하는 데 사용 조건을 처리됩니다. </li></ol> 6. 대표 결과 어떤 세포의 예로는 바로 micropatterns에 모습이어야하며 1.6-1.8에서 설명하는 중요한 세척 단계 후 몇 시간은 그림 5에 표시됩니다. CYTOOchips에서 15 분 후, 둥근 헬라 세포들은 fibronectin micropatterns (그림 5A)을 준수한다는 의미 같은 거리에서 관찰하고 있습니다. 세포 문화 선박의 부드러운 흔들림에도 불구하고 고정 남아있는 경우 접착이 완료되었습니다. 여러 세포에 의해 점령 micropatterns의 수를 최소화하기 위해, 과자는 다음 cytophobic 영역을 통해 부유 세포를 제거하는 PBS로 플러시됩니다. 몇 시간 후, 완전히 micropatterns 끌었 아르 세포는 그림 5B에 표시된 사람처럼 보이게됩니다. blebbistatin, 고정 및 굴지과 핵의 얼룩과 세포의 배양 후 얻은 전형적인 단일 셀 이미지는 그림 6에서 제공됩니다. 여러 이미지와 ImageJ CellRef 매크로를 사용하여 영상 처리의 자동 취득 후, 색상 코딩된 주파수지도 굴지의 강도 모든 세포 이미지 (6C 6F 및 그림)를 통해 평균을 묘사되는 생성됩니다. nontreated 및 취급 조건을 참조 셀의 비교 연구에서 표현형 쉽게 관찰하기 위해이 방법의 가능성을 보여줍니다 및 셀룰러 약물 효과를 탐험 특히 유용합니다. 세포에 blebbistatin의 효과 중 하나가 가능한 분석의 예제는 그림 7에 표시됩니다. 붕괴 세포의 번호 (이론 hypotenuse에 따라 기존의 빈 공간 ie. 전지) 50 컨트롤 세포에 감지하고 ImageJ의 Hypotenuse 매크로에 의해 감지는 5 μm의의 blebbistatin 대우 50 전지가 표시됩니다. blebbistatin 취급 인구의 붕괴 세포의 증가 숫자는 스트레스 섬유 세포 내에 수축성 actinomyosin 세력의 blebbistatin 억제로 인한 세포막에 따라서 긴장의 이완을 반영합니다. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Metamorph으로 새 저널을 만드는 방법. </P&gt; <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="그림 2" /> 자동 이미지 처리 절차의 그림 2. 플로우 차트. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 단일 세포 밖으로 필터링. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 참조 셀 구축. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 세포 시딩. A) 헬​​라 세포는 B) 헬라 세포 내 micropatterns (10X 배율)에 퍼지는 전체 이후 플러싱 단계 (4X 배율) 이후 micropatterns을 준수. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="그림 6" /> 그림 6. 컨트롤과 약물 치료 조건에 nonpatterned 및 micropatterned 세포의 비교. 헬라 세포는 3 시간 동안 씨앗 5 μm의의 1 시간 blebbistatin (하단 패널) 또는 왼쪽 치료 (패널 위)와 치료를했다. 제어 nonpatterned 세포 (A)에서 굴지 5 μm의의 blebbistatin (D) 치료시 눈에 보이지 분해 여러 섬유로 조립. L - micropatterns에서 제어 세포가 삼각형 모양 (B)를 채택하고 nonpatterned 세포 (D)에 비해 L.의 2 apices 사이의 주요 굴지 섬유 (스트레스 섬유)를 개발, blebbistatin는 L - micropatterned에 중요한 phenotypic 변화를 유도 전지 (E). 약물 효과와 제어 및 처리 조건의 비교 직접 시각화는 20 세포에서 만들어진 참조 셀 프레 젠 테이션으로 신속하게 시각하실 수 있습니다. blebbistatin는 세포의 붕괴와 주요 스트레스 섬유가 사라집니다 (F)를 처리하는 동안 각각의 세포와 마찬가지로, 명확하고 강한 스트레스 섬유, 제어 참조 셀 (C)에 존재합니다. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="그림 7" /> 그림 7. 매크로 Hypothenuse를 사용하여 세포에 blebbistatin의 효과 분석의 예. 제어 세포의 25 %가 붕괴 동안, 이것은 약화 actinomyosin 수축성 네트워크 (N = 50 세포)를 반영 5 μm의의 blebbistatin 치료 세포를 75 %로 3 배 증가했습니다.

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	<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis.">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity.">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li><li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization.">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li><li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape.">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li><li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cell+life+and+death.">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li><li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity.">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li><li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction.">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li><li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li><li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes.">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li><li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics.">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li><li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+migrating+cells,+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum.">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li><li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation.">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li><li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment.">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li></ol>

앤 Béghin 제외한 모든 저자는이 문서에 등장하는 시약 및 장비를 생산 CYTOO SA의 직원입니다.

micropattern 중 선택 5 μm의의 blebbistatin의 효과는 일반 문화 지원에 거의 감지되지만, 효율적인 부량 하나의 주요 스트레스 섬유에 굴지 집중 micropatterns에 가능합니다. 이것은 세포에 blebbistatin 효과의 정확한 양을 정함 은닉 굴지의 cytoskeleton의 시각화을 향상시킵니다. micropattern 형상의 선택은 분석의 설계에 중요하고 연구에 강조하는 phenotypic 변경에 따라 설계되었습니다. 결론 Micropatterns 특히 낮은 농도에서 약물 효과의 시각화 및 부량을 용이하게합니다. 셀 기반 assays를위한 접착제 micropatterns과 동질적인 평면 기판의 교체는 생산 데이터의 정확성, 감도 및 품질을 향상시킵니다. 결과적으로, 적은 세포는 강력한 통계 결과에게 3 달성하기 위해 분석을 위해 필요합니다. 접착제 micropatterns 기능성 연구를 향상시키고 독성 또는 간접적으로 약물 효과를 유도하지 않도록하기 위해 낮은 약물 농도에 phenotypic 변화를 탐험을위한 진정한 기회를 제공합니다. 적절한 심사 플랫폼을 사용하는 경우 micropatterns이 유전자 / 약물 검사 응용 프로그램을 개선하기위한 제약 회사의 요구 사항을 충족시킬 수 있습니다. 세포 현상을 분석하고 quantifying에 대한 micropatterns를 이용해 왔습니다 최근 간행물 중 일부는 추가 예제 3-13 아래 인용하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> 세포 배양 </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM - FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips 당신의 선택의 단백질의 흡착 수 있습니다 </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1X </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 챔버 계산하면 (Kova 슬라이드) </td><td> Prolabo </td><td> 71287.01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax - I </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (F 탈 소 혈청) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 페니실린 &amp; 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> A15 - 101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 웰스 - 판 </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 원심 분리기 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> 마약, 고정 및 immunostaining </td></tr><tr><td colspan="2" > Cytoskeleton 버퍼 1X (CB) </td><td > 시그마 </td><td > MES : M8250 KCl : I2636 MgCl : M2393 EGTA : E3889 </td><td > 10 MM MES 산도 6.1, 138mM KCl, 3mM MgCl, 2mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > 자당 </td><td > 시그마 </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15,714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> CB 1.185X 54 ML과 PFA 32% 10 ML를 섞어 </td></tr><tr><td colspan="2"> 트리튼 - X100 </td><td> 시그마 </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS의 정제 </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 알부민 혈청 보빈 (BSA) </td><td> 시그마 </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin - FITC </td><td> 시그마 </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> 시그마 </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Club 호텔 0.1M </td><td> 시그마 </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> 이미지 수집 </td></tr><tr><td colspan="2"> Epifluorescent 현미경 </td><td> 니콘</td><td> 에클 립스 티 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD 카메라 </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ 소프트웨어 </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved visualization and quantitative analysis of drug effects using micropatterned cells

지금까지, 대부분의 HCA (하이 컨텐츠 분석) 연구는 마이크로 번호판을 처리 조직 문화에 동질적인 기판에 성장 자기편 세포 라인 수행하고 있습니다. 이러한 조건에서 세포는 확산 및 세포 형태, 형태학 및 행동에 내재된 변화의 결과로 모든 방향으로 나눕니다. 전체 인구의 높은 휴대 전화의 변화는 특히 약물 개발을위한, HCA의 성공을 막는. 모든 개별 세포의 모양과 내부 극성을 정상화하기 위해 micropatterns의 능력이 중요한 병목 현상 1-2 해결을위한 엄청난 기회를 제공합니다. 액세스 및 micropatterning 기술의 사용을 촉진하기 위하여, CYTOO는 coverslip과 microwell 형식에서 사용할 수 micropatterns를 사용할 준비가의 범위를 개발하였습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 CYTOOchip micropatterns, 약물 치료, 고정 및 얼룩 자동 수집, 자동 영상 처리 및 최종 데이터 분석에 대한 셀 시딩에서 모든 절차에 대한 자세한 절차를 제공합니다. 이 예제를 통해, 우리는 micropatterns는 셀 기반 assays을 촉진하는 방법을 보여줍니다. 세포 cytoskeleton의 변경은 동질적인 기판에 대한 교양 세포의 수치 어렵지만, 모든 세포에서 세포 유착 연락처 체계적 위치로 인해 굴지의 meshwork의 재현성 조직 micropatterns 결과에 culturing 세포. 세포내 아키텍처의 이러한 정상화는 굴지의 cytoskeleton에도 작은 영향 부량과 같이 blebbistatin, 굴지 - 마이 오신의 상호 작용의 억제제를 사용하는 프로토콜 이러한 집합 시연 가능합니다.

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Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

improved-visualization-quantitative-analysis-drug-effects-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.2K 조회수.  Grenoble, France. 세포 구조를 정상화 접착제 micropatterns는 약물 효과의 검출에 감도를 증가 재현성을 개선하고 자동화된 이미지 수집 및 분석을 단순화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 기존의 세포 배양 지원을 수행하고 결과적으로 과도한 휴대 전화의 변화로 고통 받고 약물 / siRNA 심사 assays를 도움이 될 것입니다.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

연구

생체공학

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities 1-3. Studies in fields such as cancer research 4, neural engineering 5, cardiac physiology 6, and cell-matrix interaction7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.
Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization 9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning13, elastomer stamps14, inkjet printing15, additive photopatterning16, static photomask projection-lithography17, and dynamic mask microstereolithography18. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting "2.5D" structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.
Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (&lt;200 &mu;m) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.
In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Simple techniques are described for the rapid production of microfabricated neural culture systems using a digital micromirror device for dynamic mask projection lithography on regular cell culture substrates. These culture systems may be more representative of natural biological architecture, and the techniques described could be adapted for numerous applications.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse and Parkinson&#39;s disease. Acute activation of G&#945;i/o-linked receptors inhibits AC activity, whereas persistent activation of these receptors results in heterologous sensitization of AC and increased levels of intracellular cAMP. Previous studies have demonstrated that this enhancement of AC responsiveness is observed both in vitro and in vivo following the chronic activation of several types of G&#945;i/o-linked receptors including D2 dopamine and &#956; opioid receptors. Although heterologous sensitization of AC was first reported four decades ago, the mechanism(s) that underlie this phenomenon remain largely unknown. The lack of mechanistic data presumably reflects the complexity involved with this adaptive response, suggesting that nonbiased approaches could aid in identifying the molecular pathways involved in heterologous sensitization of AC. Previous studies have implicated kinase and Gb&#947; signaling as overlapping components that regulate the heterologous sensitization of AC. To identify unique and additional overlapping targets associated with sensitization of AC, the development and validation of a scalable cAMP sensitization assay is required for greater throughput. Previous approaches to study sensitization are generally cumbersome involving continuous cell culture maintenance as well as a complex methodology for measuring cAMP accumulation that involves multiple wash steps. Thus, the development of a robust cell-based assay that can be used for high throughput screening (HTS) in a 384&#160;well format would facilitate future studies. Using two D2 dopamine receptor cellular models (i.e.&#160;CHO-D2L and HEK-AC6/D2L), we have converted our 48-well sensitization assay (&#62;20 steps 4-5 days) to a five-step, single day assay in 384-well format. This new format is amenable to small molecule screening, and we demonstrate that this assay design can also be readily used for reverse transfection of siRNA in anticipation of targeted siRNA library screening.

Persistent activation of inhibitory G protein-coupled receptors results in sensitization of adenylyl cyclase signaling. To identify the essential molecular pathways, nonbiased approaches are necessary; however, this strategy requires the development of a scalable cell-based cAMP sensitization assay. Herein, we describe a sensitization assay for small molecule and siRNA screening.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

유 전적으로 변형 된 세포 이식을위한 미세 패턴 배양 플레이트에 회전 타원체 세포를 향해 유전자 형질

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

음향 분리기사용 CHO 수확세포 배양액의 1차 해명

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...