E형 간염 바이러스 연구는 효율적인 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해되었습니다. 우리의 기술은 약물 설계 및 백신 개발에 길을 포장 이러한 한계를 극복. 이 프로토콜을 통해, 우리는 다양한 세포의 감염을 용이하게, 비 봉투 와 봉투 HEV 입자 모두의 전염성 높은 티터 바이러스를 생성 할 수 있습니다.
이 프로토콜을 실행하려면 BSA-2 시설에 대한 액세스및 기본 세포 배양 기술에 대한 경험이 필요합니다. 플라스미드 DNA를 선형화하려면 템플릿 DNA 10마이크로그램을 10마이크로리터의 완충제와 마이크로코코커스 루테우스 제한 효소의 2마이크로리터를 혼합하고 최종 부피를 물과 함께 100 마이크로리터로 조정합니다. 그런 다음 37°C에서 1시간 동안 용액을 배양하고 표준 프로토콜에 따라 아가로즈 젤 전기포에 의한 플라스미드의 선형화를 확인한다.
플라스미드 DNA 절연 및 선형화 후, 비소화 플라스미드 DNA를 겔 전기포진에 의한 소화된 플라스미드 DNA와 비교하여 선형화의 성공을 확인할 수 있다. 정제된 전신 E형 간염 바이러스 DNA의 체외 전사를 위해, 선형화된 DNA 템플릿의 2마이크로그램을 적절한 시약과 혼합하고 핵없는 물을 사용하여 용액의 최종 부피를 100 마이크로리터로 가져옵니다. 철저한 혼합 후, 섭씨 37도에서 2 시간 동안 용액을 배양하십시오.
2 시간 후에, 튜브에 T7 RNA 폴리머라제의 추가 2개의 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 반응을 혼합하고 또 다른 2 시간 동안 섭씨 37도에서 튜브를 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 초기 DNA 템플릿을 7.5 마이크로리터의 DNA로 소화하고 30분 동안 섭씨 37도에 대한 철저한 혼합 및 인큐베이션을 사용한다.
추출 후 표준 프로토콜에 따라 아가로즈 젤 전기포에 의해 RNA 무결성 및 수율을 신중하게 확인합니다. 낮은 RNA 분다시의 경우, 흐린 얼룩이 아닌 뚜렷한 밴드를 관찰해야 한다. 일부 단계에는 빠른 실행이 필요하므로 철저한 준비가 필요합니다.
또한 RNA 무결성 및 세포 생존 가능성에 특별한주의를 기울입니다. 세포 배양 유래 E형 간염 바이러스 생산을 위한 인간 간암 세포를 준비하기 위하여는, 완전한 DMEM의 20 밀리리터에 있는 세포를 15센티미터 콜라겐 코팅 배양 접시에 종자하고 90%의 합류에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다. 배양의 끝에서, 37섭씨에서 0.05%의 트립신-EDTA의 3밀리리터로 세포 배양 판에서 분리하기 전에 PBS의 10 밀리리터로 세포를 세척하십시오.
완전한 DMEM의 10 밀리리터에서 분리 된 세포를 다시 중단하고 계산을위한 50 밀리리터 원판 튜브로 세포를 전송합니다. 5회 10번을 6개의 세포로 새로운 50밀리리터 튜브로 옮기고 세척당 PBS 35밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 상체를 제거하지 않고 얼음에 세포를 배치합니다.
대상 세포의 전기 화의 경우, 2 밀리머 ATP와 5 밀리머 글루타티온과 사이토 믹스의 384 마이크로 리터를 보충, 이후 추가 사용까지 얼음에 저장. 상체를 전체 400 마이크로리터용 으로 신중하게 교체하십시오. 5마이크로그램의 정제된 바이러스 게놈 RNA를 세포에 추가하고 세포 현탁액을 975 마이크로패드및 20밀리초 동안 전기 포기화를 위한 4mm 큐벳으로 전달합니다.
전기화 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포를 가능한 한 빨리 완전한 DMEM의 11 밀리리터로 옮기고 전기 화 세포의 10 밀리리터를 콜라겐으로 코팅한 10센티미터 배양 접시로 전달합니다. 다음으로, 콜라겐 코팅 24 마이크로티터 플레이트의 한 웰에 있는 커버 슬립에 배지 300 마이크로리터에 1.3배 10배를 추가하고 24시간 동안 세포 배양 배양에 접시와 접시를 놓는다. 다음 날, 신선한 DMEM의 10 밀리리터로 요리의 상체를 교체하고 추가 6 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
5~7일째, 세포 밀도에 따라, 총 수의 세포 수로 정규화된 관심의 표적 단백질을 표현하는 세포의 수를 계산할 수 있도록 형질 조절의 면역형 염색을 수행한다. 성공적인 전기기화는 경질 제어의 면역 형광 염색에 의해 감시될 수 있다. 상기 전환 효율은 40%를 초과해야 하며, 복제 결핍 돌연변이제는 염색의 특이성을 확인하기 위한 부정적인 제어역할을 할 수 있다.
세포외 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자를 수확하기 위해, 6일째에 0.45 마이크로리터 메쉬를 통해 초신수를 걸러서 세포 이물질을 제거하고 수확된 세포 세포 배양-E형 간염 바이러스를 섭씨 4도에서 저장한다. 세포 내 세포 배양 유래 E형 간염 바이러스 입자 수확을 위해 PBS로 세포를 세척하고 섭씨 37도에서 0.05 %의 트립신-EDTA의 1.5 밀리리터로 세포를 분리하십시오. 세포가 분리되면, DMEM의 8.5 밀리리터로 반응을 멈추고 원심분리를 위해 50 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 전달한다.
개별 2 밀리리터 반응 튜브에 전기 화당 DMEM 의 1.6 밀리리터를 추가하고 세포를 다시 중단하는 매체의 800 마이크로 리터를 사용하여 세포를 튜브로 이송합니다. 액체 질소에서 세포를 동결하고, 그 후 10, 000 g에서 10 분 동안 결과 용액을 원심 분리하기 전에 얼음에 세포를 세 번 해동. 그런 다음 수퍼네티츠를 영하 80도 저장을 위해 셀 파편 펠릿을 방해하지 않고 새로운 튜브로 옮기십시오.
새로 생산된 인트라 및 세포외 E형 간염 바이러스 주식의 티터를 평가하기 위해, 콜라겐 코팅 96웰 마이크로티터 플레이트의 60중앙 우물에 잘 100 마이크로리터 당 MEM의 100 마이크로리터 당 4개의 세포에 2회 10번 시드하고, 100마이크로리터의 PBS마이크로리터로 가장 바깥쪽 우물을 채웁니다. 섭씨 37도에서 24시간 후, 세포의 첫 번째 행에 세포외 바이러스 입자 수퍼나티 50마이크로리터를 추가합니다. 철저하게 혼합한 후, 전세에서 다음 줄까지 셀의 50마이크로리터를 복제하여 전월체의 마이크로리터를 이전에서 다음 줄로 전송하여 웰당 1~3개의 농도로 우물 내용을 6회 연속적으로 희석시켜 세포의 마지막 행까지 복제한다.
세포 내 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자로 세포를 감염시키기 위해, 세포 내 바이러스 입자 의 마이크로리터 25마이크로리터를 세포의 맨 위 줄에 추가하고 연속적으로 희석25 마이크로리터를 사용하여 1~5비율로 세포를 연속적으로 희석하기 전에 잘 혼합한다. 그런 다음 원고의 프로토콜에 따라 면역 형광 염색 전에 7 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 배양 및 면역 염색에 이어, 플레이트는 면역형광 현미경검사를 사용하여 분석될 수 있다.
내 세포 및 세포 외 입자의 최종 티터를 면역 염색 한 후 표시된 대로 적절한 공식을 사용하여 계산할 수 있습니다. 연쇄 희석에 의한 세포 배양 유래 E 바이러스 입자를 대상으로 표적 세포 감염 후, 1회 10~5회 및 3회 사이에 밀리리터당 6개의 초점 형성 단위에서 비-포위된 세포 내 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자에 감염된 세포 배양으로부터 기대할 수 있다. 포위된 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자에 감염된 배양에서, 1회 10~20일 사이, 10~10회 사이에 글리리터당 제4 초점 형성 단위가 예상된다.
또한, 게놈 사본과 비포위된 세포내 전염성 바이러스 입자 사이의 비율은 전형적으로 세포외 세포 배양-E형 간염 바이러스 입자 감염 배양에 대해 관찰된 것보다 낮으며, 비봉투형 E형 간염 바이러스 종의 더 높은 특이적 감염성을 시사한다. 바이러스 성 입자 생산 및 표적 세포 감염은 완전한 바이러스 성 수명 주기를 필요로하며 바이러스 호스트 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 복제 역학을 수행하거나 감염 분석에서 사용할 수 있는 입자를 생성하도록 수정할 수 있습니다.
우리의 연구의 대부분은 현재 포위된 HEV에서 전염되는 입자에 달려 있습니다. 그리고 우리의 기술을 사용하는 기사는 현재 게시되고있다.
