우리의 프로토콜은 인간 적인 창 자 미생물군유전체와 인간 면역 체계를 가진 마우스를 재현적으로 만드는 것을 이용하기 위하여 이용될 수 있기 때문에, 중요합니다. 우리는 이 마우스, 이중 인간화마우스를 부릅니다. 이중 인간화된 마우스 모델은 인간 적인 창 자 미생물군유전체와 인간 면역 체계 사이의 생체 내 관계의 연구를 포함하여 기본 및 번역 생물 의학 연구 모두에 사용할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 포스트독인 장진수와 우리 실험실에서 박사 학위를 취득한 장일룬이 될 것입니다. 간과 흉선 조직을 왼쪽 신장 캡슐에 이식하려면 먼저 마우스를 후드에 넣습니다. 수술 당일, 몸 전체의 치사성 조사로 마우스를 체중 량 1그램당 12센티미터씩 치료하십시오.
적절한 수준의 침전을 확인한 후 왼쪽 측면 및 내측 주위의 각 마우스를 면도합니다. 동물의 눈에 안과 연고를 바르고 필요에 따라 귀 태그를 바치게 됩니다. 3개의 순차요오드와 70%의 이소프로판올 스크럽으로 피부를 소독합니다.
피부가 준비되면, 1~6밀리미터의 인간 태아 간 조직 조각을 트로카에 싣고, 그 다음에 1-1.6밀리미터의 인간 태아 흉선 조직 단편을 적재합니다. 포셉을 사용하여 피부를 들어 올리고 메스를 사용하여 피부에 작은 세로 절단을 합니다. 절단을 마우스 왼쪽에 있는 1.5~2cm로 확장합니다.
그리고 집게를 사용하여 근육 층을 들어 올립니다. 가위를 사용하여 근육 층을 세로로 열고 신장을 노출하기 위해 필요에 따라 절단을 확장하고 신장을 둘러싼 지방 조직을 부드럽게 잡습니다. 메스를 사용하여 신장 캡슐의 후부 끝에서 1-2 밀리미터 절개를 하고 신장의 긴 축과 평행한 절개에 미리 로드된 트로카를 천천히 삽입합니다.
신장 캡슐과 신장 사이 조직을 풀어 놓고, 그들의 일반적인 위치에 신장과 창자를 반환합니다. 그런 다음 봉합사를 사용하여 근육 층과 수술 용 스테이플을 닫아 피부를 닫습니다. 마우스를 완전한 방수까지 모니터링하여 자동 마이크로이졸라이터 케이지에 넣습니다.
수술 후 6시간 후, 마우스를 열램프 아래에 놓고 70%의 이소프로파놀로 꼬리를 소독합니다. PBS의 200 마이크로리터에서 1.5~5회 CD34 양성 인간 태아 간 조직 분리 된 혈청 줄기 세포를 동물 당 하나의 팽창 꼬리 정맥으로 주입하십시오. 그런 다음 부드러운 압력으로 출혈을 멈추고 마우스를 홈 케이지로 돌려놓습니다.
수술 후 9~12주 동안 적절한 크기의 플라스틱 빗 구속을 사용하여 한 개의 인간화된 마우스의 한 쪽 다리를 분리하고, 분리된 다리의 내측을 70%의 이소프로판올로 분사한다. 항생제와 통증 완화 연고를 수집 부위에 퍼뜨리세요. 90도 각도로 유지되는 25게이지 바늘을 사용하여 사페누스 정맥을 천자하여 EDTA 코팅 혈액 수집 튜브에 50~100마이크로리터의 혈액을 수집합니다.
적당한 양의 혈액이 얻어지면, 마우스를 케이지로 되돌리기 전에 출혈을 막기 위해 멸균 된 거즈 조각으로 부위에 압력을 가하십시오. 그런 다음 수집된 말초 혈액 샘플을 사용하여 인간 CD45, CD3, CD4, CD8, CD19 및 마우스 CD45에 대한 항체를 사용하여 혈동 세포측정에 의한 인간 면역 세포 재구성의 수준을 평가한다. 신선한 배설물 샘플 컬렉션을 위해 개별 오토클레이브 종이 봉투를 연기 후드에 넣고 각 동물이 배변할 때까지 각 가방에 마우스 한 개를 넣습니다.
그런 다음 마우스를 케이지로 돌려보내고 멸균 집게를 사용하여 각 배설물 샘플을 마우스 당 1.5 밀리리터 튜브로 영하 80도 저장하도록 옮킨다. 14일 항생제 치료가 끝나면 식수를 자동 살균물로 바꾸고 마우스를 새로운 오토클레이브 케이지로 옮킨다. 항생제의 중단 후 24 및 48 시간 대변 미생물 이식 물질의 제대로 준비 된 소스를 해동하고 혐기성 조건하에서 혐기성 챔버에서 샘플을 알리쿼트.
배설물 이식을 수행하기 위해 경구 개비지를 통해 200마이크로리터의 배설물 미생물 이식 물질을 각 실험 동물에 전달하고, 인간화된 마우스의 털이나 케이지 침구에 남은 해동 물질을 확산시킵니다. 여기서, 인간화된 BLT 마우스로부터 말초 혈액의 유동 세포측정 분석의 예가 10주 후 수술 후 나타난다. T 및 B 세포 집단은 CD4 및 CD8 양성 T 세포 하위 집합뿐만 아니라 둘 다 식별될 수 있다.
이 그래프에서 이중 인간화된 마우스를 생성하기 위해 장내 미생물군유전체를 이송하는 데 사용되는 인간 대변 기증자 샘플의 상대적 풍부를 관찰할 수 있다. 항생제 치료에 의해 유도된 비장 과 cecum에 대한 현상제 변화는 세균이 없는 동물에서 관찰된 것과 유사합니다. 대표적인 16S 리보소말 RNA 염기서열 분석 데이터의 이 주요 성분 분석 플롯은 이중 인간화된 마우스가 인간 기증자 샘플에 고유한 인간과 같은 장용 미생물군유전체를 가지고 있음을 보여준다.
이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 마우스가 건강하게 유지하고 인간의 창자 미생물군유전체를 유지하기 위해 원치 않는 박테리아의 도입을 제한하는 것입니다. 이 모델은 개인화 된 의학을 발전시키고 인간 질병이 다른 완화 요인을 제어하는 동안 장 내 미생물군유전체에 미치는 영향을 볼 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.
