이 기술을 사용하면 작은 모델 물고기 인 일본 Madaka에서 암컷을 샘플링하고 일관된 방식으로 품질을 조사 할 수 있습니다. 특히 복부 마사지에 의한 정자 수집은이 접근법이 침습적이지 않기 때문에 동일한 물고기에 대한 반복 샘플링을 허용합니다. 또한이 기술은 Madaka 정자 냉동 보존에 적용될 수 있습니다.
정자의 질은 수정 성공의 필수 지표이므로 생태 및 전체 생산 생리학 연구에서 분석해야 할 중요한 매개 변수입니다. 시작하려면 페트리 접시에 딱 맞도록 잘라서 부드러운 홀딩 스폰지를 준비하십시오. 스폰지 중간에 직선을 자르면 물고기가 복부 쪽을 위로 향하게 할 수있을만큼 길다.
물고기를 마취 한 후 종이 타월로 부드럽게 닦아서 물고기의 복부를 말리십시오. 복부 쪽이 위로 향하도록 젖은 홀딩 스폰지의 골짜기에 물고기를 놓아 아가미가 스폰지의 마취액에 노출되도록합니다. 배설물 주변이 젖은 경우 일회용 티슈 닦음으로 복부 아래쪽을 부드럽게 말리십시오.
해부 현미경으로 흡인기 튜브가 부착 된 마이크로 피펫을 물고기의 배설물에 대십시오. 이제 무딘 끝으로 부드럽게 집게를 쥐어 짜서 물고기의 복부를 꼬리 동작으로 마사지하십시오. 물고기를 회수하려면 물고기를 수족관 시스템으로 되돌리기 전에 스폰지에서 미리 준비된 회수수로 풀어주십시오.
수집된 민트를 예열된 활성화 용액과 피펫 용액이 들어 있는 튜브에 흡인기 튜브 어셈블리를 사용하여 여러 번 위아래로 옮깁니다. 분석 전에 튜브를 튕겨서 희석된 정자를 부드럽게 균질화합니다. 물고기를 안락사 한 후 이전에 시연 한대로 말리고 왼쪽 측면이 위를 향하도록 해부 현미경 아래에 물고기를 놓습니다.
작은 해부 가위를 사용하여 배설물에서 등쪽으로 플랩을 자른 다음 갈비뼈를 가로 질러 아가미까지 잘라 내부 장기를 노출시킵니다. 고환을 찾아 미세한 집게로 양쪽 끝의 부착물을 자릅니다. 고환을 제거하고 예열 된 활성화 용액이 들어있는 준비된 튜브로 옮깁니다.
집게를 사용하여 튜브의 측면에 대해 고환을 여러 번 분쇄하여 정자를 방출하면 용액의 약간 흐린 모양으로 시각화 할 수 있습니다. 분석을 시작하려면 정자 분석 소프트웨어를 열고 운동성 모듈을 선택하십시오. 소프트웨어에서 모든 매개 변수에 대한 구성을 설정하십시오.
미리 데워진 일회용 20마이크로미터 계수 챔버 슬라이드를 섭씨 27도로 설정된 가열된 스테이지에 현미경 아래에 놓습니다. 샘플이 채워질 때까지 슬라이드의 챔버에 피펫팅하되 과도하게 채우지 마십시오. 용액에서 세포의 드리프트 이동을 방지하기 위해 챔버 입구에서 과도한 샘플을 조심스럽게 닦아냅니다.
분석을 선택하여 현미경으로 샘플을 봅니다. 현미경의 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 분석을 다시 선택하여 현장에서 정자를 기록합니다. 슬라이드를 프레임에서 샘플의 새 영역으로 이동하고 3-5개의 다른 시야에 대해 절차를 반복하여 기포, 셀 덩어리 또는 아티팩트를 방지합니다.
결과를 보려면 결과를 선택하고 필드를 두 번 클릭하여 개별 필드를 시각화하거나 레이블이 잘못 지정되거나 추적되지 않은 정자가 있는지 수동으로 확인합니다. 필요한 경우 개별 정자를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 운동성을 다시 표시합니다. 본 연구에서는 컴퓨터 보조 정자 분석을 사용하여 다양한 속도 및 이동 매개 변수를 기록했습니다.
계산된 값에는 직진도 지수, 선형성 지수 및 흔들림이 포함됩니다. 활성화 용액의 삼투압은 고환 해부에서 정자의 운동성에 영향을 미쳤습니다. 정자는 수족관 물에서 움직이지 않지만 HBSS에서는 삼투압이 높고 낮습니다.
그러나 운동성은 더 높은 삼투압 용액에 비해 킬로그램 당 36 밀리 삼투압에서 현저히 감소합니다. 운동성은 또한 정자 수집 방법에 의해 영향을 받았으며, 여기서 정자는 복부 마사지에 비해 고환 해부 방법에서 훨씬 더 운동성이 있습니다. 또한, 더 높은 비율의 세포는 점진적이었고 더 많은 세포는 중간 또는 빠르게 움직였다.
백분율 운동성과 진행성은 섭씨 27도 저장에 비해 섭씨 4도 또는 얼음에 저장된 정자에서 훨씬 더 높습니다. 환경 및 주거 조건도 정자 운동성에 약간 영향을 미쳤습니다. 산란 후와 산란 전에 수집 된 정자에서 정자 운동성에 큰 차이가 나타나지 않았습니다.
한 달 동안 암컷없이 수용 된 수컷은 높은 운동성을 보였지만 그 차이는 미미했습니다. 복부 마사지를 통한 정자 수집을 위해서는 적절한 집게 압력과 움직임을 배우고 대변 오염을 피하기 위해 훈련이 필요합니다. 이 기술은 예를 들어 Medaka가 일반적으로 사용되는 모델 인 생태 독성학 연구에서 남성 생식력에 대한 다양한 오염 물질의 영향을 조사하는 데 매우 유용합니다.
