여기에 제시된 객관적인 실험실 방법은 인간의 알레르기 성 접촉 피부염을 모방 한 생쥐의 접촉 과민 반응을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접촉 과민 반응은 귀 부종뿐만 아니라이 반응과 관련된 세포 메커니즘을 연구 할 수있는 다양한 실험실 검사에 의해 측정 될 수 있습니다. 보다 접촉성 과민성 모델은 다양한 환경 요인과 새로운 물질을 테스트하여 테스트 된 요인이 새로운 치료법을 구현하는 데 사용할 수있는 T 세포 의존성 면역 반응을 조절하는지 여부를 보여줄 수 있습니다.
면도날로 마우스 피부를 면도하고 발에 라벨을 붙이는 것으로 시작하십시오. 접촉 과민증 (CHS)이 유도되기 6 시간 전에 회색 비누를 물로 바르고 마우스의 가슴과 복부에 2cm 정사각형 영역을 면도하십시오. 같은 날, 이전에 면도한 부위에 갓 준비한 5%합텐 150마이크로리터를 적용하여 생쥐를 민감하게 만듭니다.
제어 마우스에서는 차량만 적용합니다. 동물을 새장에 다시 넣기 전에 합텐 지점을 30초 동안 건조시킵니다. 4일째에는 실험군을 알지 못하는 관찰자에 의해 0시간에 마이크로미터를 사용하여 마취된 마우스의 귀 두께를 측정합니다.
그런 다음 시험군과 대조군의 귀 양쪽에 갓 준비한 04%합텐 10마이크로리터를 바르고 30초 동안 건조시킵니다. 5일째, 이전 0.4% 합텐 적용 후 24시간 후에 24시간 측정을 위해 귀 두께 측정을 반복합니다. 귀 두께 측정 후 24 시간이 지난 후 마우스가 여전히 깊은 마취 상태에있을 때 가위를 사용하여 가능한 한 두개골에 가깝게 귀를 잘라냅니다.
귀의 말단부에서 생검 펀치를 사용하여 직경 6mm의 펀치를 만듭니다. 분석 저울에서 각 귀 생검의 무게를 측정하고 밀리그램으로 표현합니다. myeloperoxidase 또는 MPO 분석을 위해 귀 생검을 스테인리스 스틸 비드가 있는 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 넣고 준비된 완충액 500마이크로리터를 추가합니다.
균질화기에서 10분 동안 생검을 균질화한 다음 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 냉각한 후 10분 동안 다시 균질화합니다. 생검이 균질화되면 비드를 꺼냅니다. 균질액을 섭씨 영하 20도에서 30분 동안 동결합니다.
샘플을 해동 및 소용돌이치고 균질화 및 동결 절차를 세 번 반복합니다. 완료되면 균질액을 섭씨 4도에서 30분 동안 3, 000G에서 원심분리합니다. MPO 활성을 측정하기 위해 피펫으로 상청액을 수확하고 단백질 1밀리그램당 단위로 발현합니다.
혈관 투과성 테스트를 수행하려면 0 일째에 마우스를 민감하게하고 4 일째에는 앞서 언급 한 절차를 사용하여 귀에 합텐을 적용하여 직접 도전하십시오. 23시간 후, 마취된 마우스에 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)에 1%Evans blue 염료를 체중 g당 8.3마이크로리터를 정맥 주사합니다. 1시간 후, 마우스를 다시 마취시켜 앞서 설명한 바와 같이 귀 생검을 수집한다.
조직에서 염료를 추출하려면 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 대기에서 18 시간 동안 1 밀리리터의 포름 아미드가 들어있는 튜브에서 생검을 배양합니다. 귀 생검을 수집 한 후, 마우스가 여전히 깊은 마취 상태에있을 때 핀셋으로 안구를 제거하십시오. 마우스에 부드러운 압력을 가하고 혈청 수집을 위해 안와후동에서 튜브로 혈액을 수집합니다.
튜브를 6번 뒤집고 혈액이 응고될 때까지 30분 동안 기다립니다. 그 후, 튜브를 1, 300 내지 2, 000 G에서 실온에서 10분 동안 원심분리한다. 앞서 언급한 절차를 사용하여 0일에 TNCB 합텐으로 기증자 마우스를 감작시킵니다. 4일째에는 피부를 소독한 후 겸자를 사용하여 마취된 마우스에서 겨드랑이 및 사타구니 림프절 또는 ALN을 분리한 다음 비장을 분리합니다.
두 현미경 슬라이드의 젖빛 끝 사이에 조직을 으깨고 기공 크기가 70마이크로미터인 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 그런 다음 1% 소 태아 혈청이 보충된 DPBS로 세포를 세척하고 섭씨 4도에서 10분 동안 300G에서 원심분리합니다. 상청액을 경사 조절하고 나머지 세포 펠릿을 1 내지 5 밀리리터의 DPBS에 재현탁시킨다.
마취된 마우스에 CHS-이펙터 세포 혼합물을 정맥 주사하기 전에 200마이크로리터의 DBPS에서 최대 7.0배 10에서 7번째 세포에 ALN과 비장의 1:1 혼합물을 준비합니다. 0시와 챌린지 24시간 후에 귀 두께를 측정합니다. 데이터에 따르면 TNCB에 감작되고 4일 후 귀에 도전한 마우스는 가짜 감작 및 유사하게 도전한 대조군 마우스에 비해 귀 부종이 크게 증가한 것으로 나타났습니다.
시험군에서 귀 부종의 증가는 귀 무게, MPO 활성, 귀 추출물의 인터페론 감마 농도, 조직학적 검사에서 부종성 진피의 변화 및 귀 혈관 투과성의 증가를 초래하였으며, 대조군 동물과 비교하였을 때 시험마우스의 혈청에서 TNP 특이적 IgG1 항체가 상승하였다. 이전에 TNCB로 감작된 기증자로부터 CHS-이펙터 세포를 받은 동물은 세포를 받지 않은 동물에 비해 귀 부종이 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 가장 중요한 순간은 접촉 과민증을 유발하는 것입니다.
합텐 용액은 휘발성이 매우 강하고 빛에 민감하므로 동물의 피부에 신속하게 적용해야합니다. 단리된 이펙터 세포에 대해 추가의 시험을 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양은 항원의 존재 하에서 증식하는 능력을 평가하기 위해 확립될 수 있다.
