사이버 생성은 여전히 새로운 미토콘드리아 DNA 돌연변이의 병원성 역할을 이해하고 아트리플라스마의 비율을 질병의 중증도와 연관시키는 최첨단 프로토콜입니다. 이 기술은 환자의 핵 배경의 기여가 결여되어있는 균질 한 핵 시스템에서 생화학 적 조사를 수행 할 수있게합니다. 이 기술은 미토콘드리아 DNA의 돌연변이의 병원성을 검증 할 수 있습니다.
생화학 적 수준에서 그 영향을 연구 할 수있게합니다 칼슘과 마그네슘이없는 1X PBS 두 밀리리터를 사용하여 섬유 아세포가 들어있는 35 밀리미터 접시를 두 번 씻으십시오. 70 % 에탄올로 접시의 바깥 표면을 닦고 알코올이 증발 할 때까지 기다리십시오. 접시에서 뚜껑을 제거하고 병에서 나사 캡을 제거하십시오.
뚜껑이 없는 각 접시를 거꾸로 뒤집어 놓고 각 250밀리리터 원심분리기 병의 바닥에 놓습니다. 천천히 각 병에 32 밀리리터의 핵 생성 배지를 첨가하여 배지가 접시에 들어가 세포와 접촉하도록하십시오. 긴 유리 목초지 피펫을 사용하여 접시에서 거품을 제거하고 번젠 불꽃으로 팁을 휘어줍니다.
나사 캡으로 각 병을 닫고 원심 분리기로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 원심분리하고 8, 000 x G.A.Aspirate에서 배지를 병에서 흡인하고 버린다. 이전에 70 % 에탄올을 뿌린 멸균 거즈에 병을 뒤집어 접시를 제거하십시오.
70 % 에탄올로 접시와 뚜껑의 바깥 표면을 닦고 에탄올이 증발 한 후 접시를 닫으십시오. 진행하기 전에 살아있는 세포에 대한 반전 현미경을 사용하여 세포플라스트 형성을 점검한다. 시토칼라신에 의해 유도된 핵의 압출로 인해 매우 길쭉한 섬유아세포를 찾으십시오.
각 35 밀리미터 접시에 1, 000, 143 행 제로 셀을 추가하십시오. 5%FBS로 보충된 두 밀리리터의 배양 배지에 재현탁하였다. 가습 된 이산화탄소 인큐베이터에 3 시간 동안 접시를 두어 유령에 143 줄 제로 셀을 정착시킵니다.
세 시간의 인큐베이션 후, 흡인하고 배지를 버린다. 부착성 세포를 혈청 또는 MEM이 없는 DMEM 고 글루코스 배지 두 밀리리터로 두 번 세척한 다음, 흡인물로 배지를 폐기한다. 500 마이크로리터의 폴리에틸렌 글리콜 용액을 세포에 첨가하고 정확히 1분 동안 배양한다.
흡인물은 폴리에틸렌글리콜 용액을 버린다. 혈청 없이 또는 MEM으로 두 밀리리터의 DMEM 고 글루코스로 세포를 세 번 세척하십시오. 두 밀리리터의 융합 배지를 첨가하고, 5% 이산화탄소로 섭씨 37도의 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양한다.
나머지 배양 접시에 세포를 트립신화하여 이를 세어 하나 이상의 페트리 접시에 시드하고 클론이 나타날 때까지 보충된 배양물에 접시 당 50 내지 100개의 세포를 첨가한다. 그런 다음 며칠 동안 자라게하십시오. 스테레오 현미경을 사용하여 복제 실린더 또는 피펫 팁이있는 Petri 접시에서 클론을 집어 들으십시오.
서로 다른 클론을 풀링하는 것을 피하고 200 마이크로 리터의 보충 된 배양 배지를 포함하는 각 웰 플레이트 인 96 웰 플레이트로 옮기십시오. 사이브리드는 미토콘드리아 근병증, 뇌병증 젖산증, 및 뇌졸중 유사 에피소드와 관련된 가장 흔한 미토콘드리아 DNA 돌연변이 중 하나인 헤테로플라스마 M2343A2G를 운반하는 환자로부터 유래된 섬유아세포로부터 출발하여 생성되었다. 가변 탠덤 반복의 분석은 사이버 DNA가 환자의 사이버 DNA를 143 B 게놈으로 대체하는 것을 확인하는 행 제로 세포와 동일하다는 것을 보여주었다.
제한 단편 길이 다형성, 또는 시퀀싱 분석은 미토콘드리아 DNA 돌연변이의 존재 및 헤테로플라스마 백분율을 평가하는데 사용될 수 있다. 이 프로토콜을 시도 할 때 핵과 미토콘드리아 DNA의 정확한 유전 자산뿐만 아니라 재 채워진 사이브리드의 미토콘드리아 DNA 양을 확인하는 것이 중요합니다.
