당사의 프로토콜은 성인 인간 원발성 심근세포의 수축성을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 시스템을 설명합니다. 당사의 시스템은 여러 세포의 수축성을 병렬로 지속적으로 측정하고 약물 효과의 실시간 추적을 가능하게 하는 중간 처리량의 비침습적 광학 기록 방법입니다. 당사의 분석법은 심부전 교정을 위해 가장 원하는 프로파일을 가진 새로운 분자의 발견을 지원합니다.
또한 약물 유발 수축 위험을 예측하기 위한 전임상 접근 방식을 제공합니다. 시작하려면 8웰 배양 플레이트의 각 웰에 단일 유리 커버 슬립을 놓습니다. 용액 B 7.2 밀리리터에 인간 재조합 라미닌 521 스톡 800 마이크로리터를 첨가하여 라미닌 밀리리터당 5마이크로그램을 제조하고 잘 혼합한다.
희석된 라미닌 용액 200마이크로리터를 커버 슬립 중앙에 추가합니다. 접시를 덮고 섭씨 4도의 냉장고에 쌓습니다. 디메틸 설폭사이드 또는 DMSO를 용액 C에 1000배 희석하여 0.1% DMSO 차량 용액을 만듭니다.
0.001 마이크로몰의 치료 노출의 1배, 10배, 100배 및 1000배에서 화합물을 테스트하려면 화합물을 1밀리몰 농도로 DMSO에 용해시킵니다. DMSO 테스트 화합물 용액을 DMSO로 연속적으로 희석하여 3개의 추가 스톡을 생성합니다. 마지막으로, 각 시험 화합물 스톡 1000 old를 용액 C 50 밀리리터에 희석하여 최종 시험 농도를 얻습니다.
차량 용액과 화합물의 최종 마이크로몰 농도 용액을 50밀리리터 주사기에 추가합니다. 주사기를 중력 흐름 시스템에 연결한 다음 중력 흐름 시스템을 프라이밍합니다. 라미네이트 코팅된 커버 슬립이 들어 있는 8웰 플레이트를 냉장고에서 꺼내고 커버 슬립 하나를 깨끗한 녹음실에 넣습니다.
다음 플레이팅이 될 때까지 접시를 냉장고에 다시 넣으십시오. 에스컬레이션된 바이알에서 용액 B를 흡입하여 세포 손실 없이 가장 작은 부피에 도달합니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 세포 용액을 도립 현미경의 스테이지에 장착 된 기록 현미경 챔버에 분배하고 세포가 커버 슬립에 5 분 동안 정착되도록합니다.
그런 다음 현미경의 시야를 열고 세포 밀도가 실험 실행을 시작하기에 적합한지 확인합니다. 도금이 완료되면 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 용액 C로 세포를 지속적으로 관류하여 5분 동안 세포를 평형화합니다. 흡입을 올바르게 조정하고 온도 조절 상자와 가열판을 켜고 섭씨 35도를 전달하도록 설정합니다.
그런 다음 챔버의 반대쪽에 배치된 한 쌍의 백금 와이어가 있는 전계 자극기에서 1Hz 페이싱 주파수에서 초임계 전압으로 세포를 자극합니다. 자극 펄스의 진폭을 1볼트로 설정하고 심근세포가 수축-이완 주기를 생성하기 시작할 때까지 진폭을 늘립니다. 막대 모양의 형태와 선명한 줄무늬를 가진 건강한 세포를 선택한 다음 시야를 조정하고 가능한 한 많은 수축 세포를 시야에 가져오는 데 집중합니다.
다음으로, 광학 수축성 기록 시스템의 획득 소프트웨어 내에서 세포의 디지털화된 이미지를 표시했습니다. 관심 영역 또는 ROI를 선택할 때 초점이 맞지 않는 영역과 셀 가장자리에 가까운 영역을 피하십시오. 화합물의 효과를 평가하기 위한 실험을 시작합니다.
수집 소프트웨어는 데이터 수집을 관리합니다. 테스트 농도 및 처리 시간을 자동으로 표시하고 라벨링합니다. 수축이 기준선 차량 기간 전체에 걸쳐 안정적인 진폭으로 유지되는 경우 테스트 농도를 적용합니다.
런업 또는 런다운을 표시하는 셀을 부적합 합니다. 분석 소프트웨어와 맞춤형 매크로를 사용하여 오프라인 분석을 수행하여 데이터의 평균을 구합니다. 이 소프트웨어는 수집 소프트웨어에 의해 생성된 육종 역학 데이터로부터 다양한 메트릭을 계산하고 보고합니다.
각 심근세포의 특정 기준 차량 제어 조건에 대한 평균 수축성 진폭에 대한 테스트 화합물 효과를 정량화합니다. 평균 결과를 평균 플러스/마이너스 SEM으로 표현하고 수축성 진폭에 대한 테스트 화합물의 농도 효과를 플로팅하는 그래프를 생성합니다. 그런 다음 농도 반응 곡선을 언덕 방정식에 피팅하여 IC50 및 EC50 값을 도출합니다.
다음으로, 수축 후를 다음 정기 수축 전에 발생하고 비정상적이고 동기화되지 않은 수축을 일으키는 심근세포의 일시적인 자발적인 이차 수축으로 식별합니다. 수축 실패를 전기 자극이 수축을 유도할 수 없는 것으로 식별합니다. 수축 진폭 변동성에 대한 푸앵카레 플롯에서 단기 변동성(STV)과 교류를 시각화합니다.
각 대조군 및 테스트 항목 집중 기간의 마지막 20회 과도 현상으로 STV를 계산합니다. 그런 다음 alternans를 반복적이고 짧고 긴 수축성 진폭 과도 현상으로 번갈아 식별합니다. 부정맥 전증의 발생률을 계산하려면 STV 값을 각 세포의 차량 제어 값으로 정규화하고, 수축 후, 수축 실패, STV 및 알터난을 플로팅하고 각 신호를 나타내는 세포의 발생률에 대한 백분율로 표현합니다.
피크까지의 시간, 30%로 감쇠한 다음 90%완화, 90%완화까지의 시간, 기준선 육종 길이, 50%피크까지의 시간, 피크 높이, 최대 수축성에서의 육종 길이, 최대 수축 속도 및 최대 완화 속도를 계산하여 다중 모수적 기계 프로파일링을 완료합니다. 그런 다음 각 심근세포의 특정 기준선 제어 조건과 관련하여 이러한 매개변수를 표현하고 농도 반응 플롯에 그래프로 표시합니다. 이 연구는 인간 심근세포 수축율 측정 검증 및 베타-아드레날린 자극의 효과를 보여줍니다.
인간 심근세포에는 자발적인 수축성 과도 현상이 없었으며, 심근세포는 수축성-이완 주기로 외부 전기 자극과 베타-아드레날린성 작용제인 이소프로테레놀에 반응합니다. 이소프로테레놀은 수축성의 농도 의존적 증가를 일으키며, 수축성 과도의 동역학에 대한 효과도 특성화되었습니다. 수축성의 측정에 이어, 형광등으로 과도칼슘의 측정을 실시할 수 있습니다.
이러한 데이터는 수축성의 변화가 칼슘 역학의 변화를 필요로 하는지 여부를 결정하는 데 도움이 됩니다. 우리의 방법은 심장 연구자들이 인간 심근세포의 생리학 및 약리학에 대한 더 나은 이해를 개발하고, 신약의 구조, 활성 및 관계를 확립하고, 작용 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.
