이 프로토콜은 비표적 대사체학 분석 동안 알팔파에 대한 생체이물의 영향을 평가하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 작동이 매우 간단하고 편리하며 더 많은 유형의 뿌리 삼출물을 식별 할 수 있습니다. 식물 뿌리 삼출물의 대사 지문을 구성하는 데 도움이 됩니다.
10 분 동안 0.1 % 차아 염소산 나트륨으로 씨앗을 헹구어 medicago sativa 또는 알팔파 씨앗의 살균을 시작하십시오. 그런 다음 75% 에틸 알코올로 30분 동안 세척합니다. 다음으로, 멸균 된 씨앗을 증류수로 여러 번 헹굽니다.
그런 다음 멸균 페트리 접시에 놓인 축축한 여과지에서 발아시킵니다. 어둠 속에서 섭씨 30도. 발아 후, 균일하게 발아된 크고 통통한 씨앗 20개를 영양액으로 채워진 배양병에 담아 생착 바구니에 옮깁니다.
모든 배양 병을 제어된 조건의 성장 챔버에 넣습니다. 2 주 후, 15 개의 균일 한 알팔파 묘목을 새 유리 병에 옮겨 배양 실험을 위해 킬로그램 당 1 밀리그램 및 킬로그램 당 10 밀리그램 DEHP 스트레스에 노출시킵니다. 처리 및 제어 유리병을 알루미늄 호일과 파라필름으로 감싸서 DEHP의 광분해 및 휘발을 방지합니다.
액체 수준을 유지하기 위해 매일 영양 용액을 보충하십시오. 알팔파 묘목의 일관된 성장 조건을 보장하기 위해 이틀에 한 번씩 병을 무작위로 놓고 회전시킵니다. 7 일간의 재배 후 병에서 알팔파 묘목을 제거하십시오.
그리고 초순수로 여러 번 씻어서 뿌리 삼출물 수집을 준비하십시오. 10개의 균일한 알팔파 묘목을 50밀리리터의 멸균된 탈이온수로 채워진 원심분리기 튜브에 옮겨 뿌리 삼출물 수집 실험을 시작합니다. 뿌리 삼출물을 수집하려면 뿌리를 물에 담근 상태에서 튜브를 6시간 동안 똑바로 세워 두십시오.
완료되면 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 뿌리를 보호합니다. 식물을 제거하고 대사 산물 프로파일링을 위해 수집된 액체를 동결 건조합니다. 동결 건조된 샘플에 1.8 밀리리터의 추출 용액을 첨가하여 추출 실험을 진행한다.
30 초 동안 소용돌이에서. 다음으로, 얼음물 욕조에서 10 분 동안 튜브에 초음파를 적용하십시오. 샘플을 원심분리하기 전에.
200마이크로리터의 상등액을 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 원심분리기 튜브에서 45마이크로리터의 상층액을 흡인하고 품질 관리 또는 QC 샘플에 혼합하여 최종 부피 270마이크로리터로 만듭니다. 완료되면 진공 농축기에서 추출물을 동결 건조합니다.
건조가 완료되면 5마이크로리터의 내부 표준 리보뉴클레아제를 첨가하고 건조를 계속합니다. 증발 후, 30 마이크로 리터의 메톡시 아민화 염산염 용액을 첨가하고 튜브를 섭씨 80도에서 30 분 동안 배양한다. 다음으로, 유도체화를 위해 튜브를 섭씨 70도에서 1.5시간 동안 놓기 전에 샘플에 40마이크로리터의 BSTFA 시약을 추가합니다.
배양이 끝나고 유도체화된 샘플이 실온에 도달하면 클로로포름에 용해된 지방산 메틸 에스테르 5마이크로리터를 유도체화된 샘플에 추가합니다. 30m x 250μm x 0.25μm 크기의 모세관 컬럼을 사용하여 분당 1.0밀리리터의 유속으로 운반 가스 헬륨으로 뿌리 삼출물 1마이크로리터를 분리합니다. 사출 온도를 섭씨 280도로 설정합니다.
그리고 이송 라인 온도를 섭씨 280도로 유지하십시오. 분리를 위한 오븐 프로그램을 설정합니다. 추출물을 분리한 후 마이너스 70전자 볼트의 에너지로 전자 충돌 모드에서 질량 분석을 수행합니다.
이온 소스 온도를 섭씨 250도로 유지합니다. 초당 12.5 스펙트럼의 속도로 전하로 50 - 500 질량의 질량 스캔 범위를 가진 전체 스캔 모니터링 모드를 사용하여 질량 스펙트럼을 얻습니다. 778개의 피크가 대조군 샘플의 크로마토그래프에서 검출되었습니다.
그 중 314개의 대사산물이 질량 스펙트럼에 따라 확인되었습니다. 산은 지방산, 아미노산, 유기산 및 페놀산으로 더 세분되었습니다. 또한 피리미딘, 하이드록시 피리미딘, 플라보노이드, 페놀, 케톤, 피리미딘 및 디테르펜을 포함한 알팔파 뿌리 삼출물에서도 뿌리 삼출물에 일반적으로 존재하는 일부 일반적인 물질이 검출되었습니다.
VIP 점수를 기반으로 히트 맵을 그려 다양한 DEHP 치료 간의 차등 대사 산물의 변화를 시각화했습니다. 대조군 샘플과 비교하여 DEHP 노출은 50 개의 대사 산물과 알팔파 뿌리 삼출물의 함량을 크게 변화 시켰습니다. 주로 일부 탄수화물과 저분자량 유기산을 포함합니다.
대사 경로 분석 결과 DEHP는 광합성의 산물인 탄수화물의 대사를 현저히 억제하여 DEHP가 알팔파의 광합성을 어느 정도 억제할 수 있음을 나타내었으며, DEHP는 DEHP의 스트레스에 저항하는 데 도움이 되는 지방산의 대사를 촉진하는 것으로 나타났습니다. 정확한 대사체 데이터 분석을 보장하기 위해 각 처리에 대해 최소한 종자 뿌리 삼출물을 수행해야 합니다. 우리는 차별적 인 대사를 결정하고 오염 물질의 환경 거동에서 중요한 규칙을 추가로 조사 할 수 있습니다.
식물과 더 넓은 분야의 생물학적 군집 사이의 상호 작용은 대부분 이 방법을 사용하여 해독할 수 있습니다.
