식물 캘러스 배양은 식물에서 생체이물의 대사 분해를 정확하고 효율적이며 빠르게 평가할 수 있는 솔루션을 제공합니다. 식물 캘러스 배양은 미생물군집 또는 곰팡이 간섭 및 광화학적 분해를 배제하고, 온전한 식물의 매트릭스 효과를 단순화하고, 재배 조건을 표준화하고, 처리 기간을 단축하고, 실험 노력을 덜 필요로 할 수 있습니다. 여기에 제안 된 방법은 작물에 대한 다양한 유기 오염 물질의 흡수 행동과 대사 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있으며 환경 위험 평가 노력에 유용합니다.
시작하려면 모든 장비를 오토클레이브하고 UV 살균된 울트라 클린 작업대에서 모든 작업을 수행하십시오. vernalized 종자 표면을 75 % 에탄올로 20 분 동안 소독하십시오. 멸균 탈이온수로 세 번 헹구고 20% 과산화수소로 20분 동안 다시 멸균합니다.
멸균된 탈이온수로 종자를 6회 세척한 후, 1%한천겔이 함유된 pH 5.8의 호르몬이 없는 무라시게와 스쿠그 배지에 파종하여 무균적으로 발아시키고 섭씨 26도에서 15일 동안 16시간 배양한다. 종자 배양 15 일 후, 묘목의 배축과 자엽을 0.5 센티미터의 작은 조각으로 잘라 외식편을 얻는다. 옥시몬과 피코시아닌이 보충된 15-20밀리리터의 오토클레이브 무라시게 및 스쿠그 배지가 들어 있는 페트리 접시에 체식편을 변형시키고 섭씨 26도의 어두운 곳에서 3-4주 동안 배양하여 굳은살을 유도합니다.
멸균 메스와 집게를 사용하여 초기 외식편에서 형성된 직경 약 1cm의 캘러스를 분리합니다. 처리를 위해 2, 4- 디 브로 모 페놀을 10 밀리리터의 무균 액체 Murashige 및 Skoog 배지에 용해시킵니다. 그런 다음 준비된 2, 4- 디 브로 모 페놀 용액에 분리 된 당근 캘러스 3g을 첨가하십시오.
원고에 기재된 바와 같이 블랭크 대조군에서 배지를 준비한 후, 모든 플라스크를 어둠 속에서 인큐베이션한다. 시료를 준비하기 위해, 캘러스를 2, 3-디브로모페놀 처리 및 대조군 플라스크로부터 조심스럽게 분리하고, 0.45 미크론 유리 섬유 필터로 여과하여 여과한다. 굳은살을 채취하기 전에 초순수로 세 번 씻으십시오.
수집 된 모든 캘러스를 동결 건조시키고 건조 된 캘러스 0.2g을 70 헤르츠에서 3 분 동안 고 처리량 티슈 그라인더로 균질화합니다. 유리 미세 주사기를 사용하여 50마이크로리터의 대리 중수소화 4-n-나노페놀을 균질화된 캘러스에 넣고 1분 동안 소용돌이칩니다. 스파이크 캘러스에 동일한 비율의 메탄올과 물을 함유 한 용액 5 밀리리터를 첨가하고 30 분 동안 초음파 처리하여 2, 4- 디 브로 모 페놀 및 대사 산물을 추출합니다.
추출 후, 현탁액을 섭씨 4도에서 8, 000 G에서 10 분 동안 원심 분리하고 피펫 팅으로 상청액을 수집한다. 분당 1밀리리터의 유속으로 친수성, 친유성, 균형 고체상 추출 또는 HLB-SPE 카트리지를 통해 추출물을 통과시킵니다. 6밀리리터의 메탄올을 HLB-SPE 카트리지에 통과시켜 분석물을 희석합니다.
그런 다음 기기 분석을 위해 얻은 용리액을 부드러운 질소 가스 흐름 하에서 1 밀리리터로 농축합니다. 분석을 위해 컬럼 히터 도어를 엽니다. 그런 다음 컬럼 입구를 주입 밸브에 연결하고 출구를 질량분석기의 입구에 연결하여 초고성능 액체 크로마토그래피 컬럼을 설치합니다.
솔벤트 튜브 A와 B의 끝을 해당 솔벤트 병에 삽입합니다. 샘플 트레이의 해당 위치에 일련 번호로 샘플 바이알을 배치하고 샘플 트레이를 샘플 챔버에 다시 삽입합니다. 소프트웨어 창에서 Instrument(기기)를 클릭한 다음 Inlet Method(유입 방법)를 클릭하여 액체 크로마토그램의 조건을 편집합니다.
MS Method를 선택하고 질량 스펙트럼 분석의 파라미터를 설정합니다. File(파일)을 클릭한 다음 New(새로 만들기)를 클릭하여 데이터베이스를 만들고 이름을 지정합니다. MS File(MS 파일)을 선택한 다음 Inlet File(인렛 파일) 및 Inject Volume(볼륨 주입)을 선택하여 위에서 만든 샘플 프로그램을 로드합니다.
File and Save(파일 및 저장)를 클릭하여 프로젝트의 샘플 폴더에 데이터베이스를 저장합니다. 그런 다음 기본 소프트웨어 창에서 Run and Start(실행 및 시작)를 선택하고 Acquire Sample Data(샘플 데이터 수집)를 클릭한 다음 시작 샘플 목록 실행에서 OK(확인) 버튼을 클릭하여 데이터를 수집합니다. 데이터를 처리하려면 대상 데이터 행을 선택하고 크로마토그램 창을 클릭하여 MS 스캔 크로마토그램을 봅니다.
크로마토그램 창에서 디스플레이를 클릭한 다음 TIC를 클릭합니다. 스캔 웨이브 DS를 클릭한 후 trace와 OK를 추가하여 딸 질량 스펙트럼 스캔을 가져옵니다. 2,4-디브로모페놀 처리된 당근 캘러스 추출물의 크로마토그램은 대조군 샘플과 비교하여 8개의 다른 대사 산물의 존재를 보여주었습니다.
또한, 크로마토그램에서 부모 2, 4-디브로모페놀 피크의 부재는 실험 조건 하에서 당근 캘러스에서 2,4-디브로모페놀의 빠른 대사를 나타냅니다. 또한, 당근 캘러스에서 배양된 2, 4-디브로모페놀은 포도당 및 아미노산과의 직접 접합에 의해 대사 산물을 형성했습니다. Murashige 및 Skoog 배지뿐만 아니라 모든 장비는 식물 캘러스의 분화 및 유지 관리가 무균 조건에서 수행되도록 고압 증기 멸균해야합니다.
이 절차를 따르는 오믹스 접근법을 통해 환경 오염 물질에 대한 명확한 식물 독성 기계론적 그림을 만들 수 있습니다.
