당사의 프로토콜은 유세포 분석과 같은 단일 세포 유전자 발현 분석에 적합한 잎 아포플라스트에서 자란 박테리아 개체군을 회수할 수 있는 부드러운 식물 접종 및 추출 방법을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 식물 세포 파편으로 샘플을 크게 오염시키지 않고 아포 플라스트에서 상당한 양의 박테리아를 추출 할 수 있습니다. 아포형성 박테리아 회수를 위한 이 최적화된 방법은 식물 병원성 박테리아 또는 유익한 내세포 박테리아를 포함하는 여러 식물 박테리아 시스템에 직접 또는 약간의 수정을 가하여 적용할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 과정 학생 인 Nieves Lopez-Pagan이 될 것입니다. 시작하려면 직경 10cm의 화분에 이전에 물을 뿌린 1:3 질석 식물 기질 혼합물을 채웁니다. 구멍이 뚫린 금속 메쉬로 냄비를 덮고 고무 밴드를 사용하여 금속 메쉬를 젖은 토양에 맞게 조정하십시오.
다음으로, 젖은 이쑤시개로 금속 메쉬의 구멍에 애기장 씨앗을 뿌립니다. 냄비 안의 먼 위치에 3-4 개의 씨앗을 놓습니다. 높은 상대 습도를 유지하기 위해 플라스틱 돔으로 냄비를 덮고 섭씨 4도에서 72시간 동안 성층화를 위해 배양합니다.
짧은 하루 조건에서 화분을 식물 성장 챔버로 옮깁니다. 냄비를 드러내려면 플라스틱 돔을 제거하십시오. 씨앗이 발아되면 핀셋을 사용하여 대부분의 묘목을 제거하고 냄비의 각 위치에 하나의 묘목을 유지합니다.
그런 다음 페트리 접시의 바닥을 젖은 종이 타월로 덮고 그 위에 콩 씨앗을 올려 Phaseolus vulgaris 콩 식물을 준비합니다. 페트리 접시를 수술 용 테이프로 밀봉하고 섭씨 28도에서 3-4 일 동안 배양합니다. 발아된 씨앗을 습식 1:3 질석 식물 기질 혼합물로 채워진 직경 10cm 화분에 옮기고 장시간 설정에서 식물 성장 챔버에서 배양합니다.
섭씨 영하 80도에서 관심 있는 Pseudomonas syringae 균주의 글리세롤 스톡을 적절한 항생제가 보충된 LB 플레이트에 줄무늬로 채취합니다. 플레이트를 섭씨 28도에서 40 내지 48시간 동안 배양한다. 박테리아 바이오매스를 긁어내고 5밀리리터의 10밀리몰 염화마그네슘에 다시 현탁합니다.
600 나노 미터에서 광학 밀도를 측정하고 10 밀리몰 염화 마그네슘을 첨가하여 0.1로 조정하십시오. 10 밀리몰 염화 마그네슘에서 연속 희석을 수행하여 밀리 리터 당 10에서 5 번째 CFU의 5 배의 최종 접종 농도를 얻습니다. 그런 다음 애기장대 식물에 200밀리리터, 콩 식물에 50밀리리터의 접종물을 준비합니다.
접종 전에 계면활성제인 Silwet L-77을 최종 농도(콩 접종의 경우 0.02%, 애기장대의 경우 0.01%)로 첨가합니다. 애기장대 침투의 경우 냄비 위에 X를 형성하는 두 개의 나무 막대기를 놓고 14밀리리터의 접종물이 들어 있는 직경 200cm의 페트리 접시 위에 냄비를 아래로 향하게 놓습니다. 콩 잎 접종을 위해 식물과 접종 용액을 진공 챔버에 넣고 접종 물이 들어있는 50 밀리리터 원추형 원심 분리기 튜브에 잎을 넣습니다.
나뭇잎에 침투하기 위해 30 초 동안 500 밀리바의 펄스를줍니다. 종이 한 장으로 초과 접종 용액을 배출하고 계획을 해당 성장 챔버로 되돌립니다. 접종 4 일 후, 애기장대 식물의 공중 부분 또는 콩 식물의 접종 된 잎을 잘라 바늘없이 20 밀리리터 주사기에 넣습니다.
콩 잎의 경우, 잎을 굴려서 축 방향면을 바깥쪽으로 남겨 둡니다. 조직을 덮을 수 있도록 충분한 양의 증류수를 첨가하십시오. 그런 다음 주사기를 똑바로 세운 플런저를 삽입하고 모든 공기가 팁 근처에 위치할 때까지 배럴을 가볍게 두드려 주사기 내부의 과도한 공기와 기포를 제거하고, 공기를 제거한 후 주사기 배럴의 끝을 파라핀 필름으로 덮습니다.
이제 플런저를 조심스럽게 눌러 조직이 어두워 질 때까지 양압을 생성합니다. 그런 다음 플런저를 당겨 음압을 생성합니다. 파라핀 필름과 플런저를 제거하고 아포플라스트가 추출한 박테리아가 포함된 유체를 수집합니다.
단일 세포 분석을 위해 증류수에 1.5% 아가로스 용액을 준비합니다. 녹으면 나란히 놓인 두 현미경 슬라이드 사이의 공간을 채울 만큼 충분한 양을 추가하고 그 위에 다른 슬라이드를 놓습니다. 15분 동안 운전하게 하고 상단에 놓인 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다.
블레이드를 사용하여 사용하기 전에 아가로스 패드를 5 밀리미터 x 5 밀리미터 조각으로 자릅니다. 병행으로, 아포플라스트가 추출한 박테리아 1mm를 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 20마이크로리터의 물에 재현탁하여 세포를 농축합니다.
농축된 세포의 2마이크로리터 방울을 0.17mm 커버 슬립에 놓고 아가로스 패드 조각으로 방울을 덮습니다. 컨포칼 현미경으로 박테리아 제제를 시각화하여 특정 레이저를 사용하여 녹색 형광 박테리아를 식별합니다. 명시야를 사용하여 모든 박테리아를 식별하고 두 필드를 병합합니다.
유세포 분석에 의한 분석을 수행하려면 아포플라스트에서 추출한 박테리아 현탁액의 분취량을 취합니다. 유세포 분석기를 사용하여 분석하고 100, 000 개의 이벤트를 수집합니다. GFP의 hrpL 발현은 GFP 형광에 의해 모니터링된다.
도트 플롯 그래프는 모집단에서 GFP 대 세포 크기의 형광 강도 분포를 보여주고, 히스토그램은 GFP 대 세포 수의 형광 강도를 보여줍니다. hrpL ON 백분율은 hrpL OFF의 해당 백분율보다 높았다. 형광 현미경 이미지는 hrpL의 발현과 관련된 GFP의 이질적인 수준을 보여줍니다.
GFP 형광이 낮거나 전혀 나타나지 않는 박테리아가 관찰됩니다. 최적의 결과를 얻으려면 박테리아 추출 단계에서 부드럽게 하여 식물 조직의 손상을 방지하고 식물 세포 내용물로 인한 오염을 제한하십시오. 얻어진 박테리아 샘플은 후속 박테리아 게놈 또는 전사체 분석을 위한 핵산 추출과 같이 식물 오염을 줄이는 것이 유리한 다른 목적으로 사용할 수 있습니다.
