종양을 눈의 뒤쪽 부분으로 설정하는 것은 어렵습니다. 이 방법은 마우스에서 재현 가능한 맥락막 흑색종 종양의 유도 및 평가를 위한 종양 성장의 라이브 이미징을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 OCT 라이브 이미징을 사용하여 종양 세포 접종 당시 이미 종양의 위치를 평가하고 살아있는 동물의 종양 성장을 추적합니다.
포도막 흑색종은 전이율이 50%에 가까운 치명적인 질병입니다. 실험 모델을 개발하는 것은 새로운 치료 가능성을 목표로 하는 연구를 발전시키는 데 중요합니다. 이 방법의 장점은 주사 성공에 대한 즉각적인 평가를 통해 균질 종양을 가진 연구 그룹에 도달하고 라이브 이미징을 통해 지속적으로 추적 할 수 있다는 것입니다.
종양 진행을 검사합니다. 작은 쥐의 눈에 주사하려면 연습이 필요합니다. 주입 된 세포를 시각화하는 기능을 통해 즉시 성공을 평가하고 필요에 따라 더 많은 마우스로 반복 할 수 있습니다.
이 절차를 시연하는 것은 Kaplan Medical Center의 Ophthalmology Research Laboratory의 Dr.Dimitri Gaber가 될 것입니다. 시작하기 위하여는, 0.4% 국소 안과 마취, Oxybuprocaine를 마취된 쥐의 양쪽 눈에 적용하십시오. 그런 다음 동공 확장을 위해 양쪽 눈에 0.5% 트로피카마이드를 국소적으로 바르고 눈의 건조를 방지하기 위해 윤활제로 1.4% 하이드록시에틸 셀룰로오스를 바릅니다.
작동 현미경으로 마우스의 한쪽 눈을 관찰합니다. 멸균 된 인공 집게로 눈꺼풀을 벌립니다. 그런 다음 상측두엽 림보-결막을 잡고 하부 비강 위치로 당깁니다.
절차 전반에 걸쳐 림보-결막을 잡고 이 위치를 고정합니다. 30 게이지 바늘 끝을 사용하여 윤부 뒤쪽 약 1-2mm의 등쪽 측두엽에 작은 결막 절제술을 합니다. 복막 절제술의 개구부에서 과도한 힘줄 캡슐을 제거합니다.
바늘 끝을 삽입하여 공막을 관통하여 맥락막의 갈색이 공막의 노출된 백질을 통해 나타날 때까지 맥락막하 공간에 트랙을 만듭니다. 45도 각도로 꼬인 32게이지 무딘 바늘이 장착된 멸균된 10마이크로리터 유리 해밀턴 주사기에 세포를 넣습니다. 적재 된 주사기의 바늘을 생성 된 관에 약 2 밀리미터 삽입하고 2 마이크로 리터의 세포 현탁액을 주입한다.
주사 후 모든 체액이 제거될 때까지 2-3초 동안 바늘을 제자리에 고정합니다. 관로에서 바늘이 새지 않도록 바늘을 부드럽게 당겨 제거합니다. 흑색종 세포 접종 직후, OCT 스캔으로 주입된 동물의 눈을 관찰한다.
스캔을 기반으로 망막 박리 또는 RD 패턴을 국소 RD, 유리체로의 누출 또는 확장된 RD의 세 가지 범주에 따라 분류합니다. OCT 분할 분석 소프트웨어를 열어 RD 높이를 기반으로 종양 크기를 예측합니다. OCT 스캔에서 로컬 RD의 높이를 측정하고 세 그룹으로 분류합니다. 수술 후 단계에서 0.3%의 Ofloxacin을 국소적으로 도포합니다.
맥락막하 세포 주입 후 종양 성장에 대한 OCT 기반 예측이 이 그림에 나와 있습니다. 마우스는 RD, Focal, Leakage To The Vitreous 및 Extended RD의 세 가지 패턴을 나타냈다. 주사 직후의 RD 패턴과 주사 5일 후 종양의 국소화 사이에는 연관성이 있었습니다. 국소 RD는 맥락막에 국한된 종양 세포 성장과 관련이 있었습니다.
그러나, Focal RD를 나타내는 동물에서 주사 후 유리체의 세포를 관찰한 결과 유리체강과 맥락막에서 종양 성장이 나타났습니다. 확장 RD가 주사 후 관찰되었을 때, 종양은 5일 후에 맥락막 및 유리체 전체에 분산되었습니다. 이 모델에서 유도된 종양 크기의 범위는 소형, 중형 및 대형으로 나눌 수 있습니다.
여기에 표시된 것은 주사 후 RD 높이의 OCT 측정의 대표 이미지, 및 해당 안저 이미지, 주사 후 5일째의 종양 높이 및 너비의 수평 OCT 스캔, 및 해당 안저 이미지 및 비교 가능한 종양 측정을 보여주는 해당 H&E 염색 눈 섹션입니다. 세포 주입 직후 소형, 중형 또는 대형 RD를 나타낸 마우스의 종양 부피 측정이 여기에 제시됩니다. 주입력을 조정하면 종양의 크기와 위치에 영향을 줄 수 있습니다.
이를 보정하고 주사 후 OCT에 의해 유도된 망막 박리 패턴을 평가하는 것이 중요합니다. 맥락막 종양의 라이브 이미징은 종양 진행에 대한 다양한 요인 또는 잠재적 치료법의 효과를 조사할 수 있는 중요한 실험 도구입니다.
