이 프로토콜은 이중 형광 형질 전환 마우스 모델에서 마우스 안구 표면의 전체 구조의 라이브 이미징을 위해 다중 필터 현미경을 사용합니다. 사용자 정의 다광 현미경 플랫폼과 이중 형광 형질 전환 마우스의 조합은 안구 표면의 실시간 시각화 및 구조를 가능하게한다. 다광현미경을 설정하려면, 물 침지 20X, 1.00 NA 목표를 선택하고 티타늄 사파이어 레이저를 직립 현미경의 여기원으로 설정합니다.
EGFP의 경우 레이저 출력 파장을 880나노미터, tdTomato의 경우 940나노미터로 설정합니다. SHG EGFP 및 EGFP tdTomato분리를 위한 두 개의 이색 거울을 포함하고 434-17, 510-84 및 585-40 나노미터 대역 패스 필터를 사용하여 SHG EGFP 및 tdTomato 신호를 관전적으로 분리한다. 눈 홀더를 설정하려면 마취 된 8-12 주 된 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후 가열 된 현미경 단계에 마우스를 배치하고 온도 모니터링 프로브를 삽입합니다.
마우스를 사용자 정의 스테레오탁스 마우스 홀더에 넣고 외부 청각 고기에 이어 바를 삽입합니다. 3점 고정을 사용하여 헤드 홀더를 확보하고 0.4%의 옥시부프로카인 염산염 및 식염수 용액을 안구 표면에 적용합니다. PE 튜브 루프와 숫자 다섯 듀몬트 집게의 쌍의 팁을 커버.
3분 후 수동 눈꺼풀 후퇴를 수행하여 눈알 돌출을 확인하고 눈꺼풀 여백을 따라 PE 홀더 튜브 루프를 조심스럽게 배치하여 안구 표면을 노출시합니다. 그리고 홀더의 손잡이를 사용하여 포셉으로 안구를 안정시합니다. 그런 다음 각막 표면을 1.338의 굴절률로 아이 젤로 덮습니다.
각막 표면의 Z 직렬 이미징의 경우 수은 광원을 사용하여 타겟팅 필드를 이미지화하고 현미경 소프트웨어를 엽니다. 안구 표면의 셀룰러 구조를 시각화하기 위한 적절한 사진 승수 및 디지털 이득을 선택하고 이미지 스택을 수집할 수 있도록 첫 번째 및 마지막 슬라이드를 설정합니다. 이미지 해상도를 512x 512픽셀로 설정하고 Z 단계를 하나의 마이크로미터로 설정합니다.
그런 다음 SHG EGFP 신호 수집을 위한 880나노미터 의 흥분으로 하나의 라이브 이미지를 획득하는 Z 직렬 이미지를 수집하기 시작하고 각 영역 내의 EGFP tdTomato 신호 수집을 위한 940나노미터 의 라이브 이미지를 수집합니다. 이미지 전반에 걸쳐 스테퍼 전동 스테이지 홀더를 사용하여 안구를 회전하여 각막 표면 전체를 이미징할 수 있습니다. 모든 이미지가 획득되면 Z 직렬 이미지를 피지에 로드하고 중앙값 3D 필터 플러그인을 선택합니다.
배경 노이즈를 제거한 후, 선명한 마스크 필터 패키지 피지를 선택하여 이미지를 선명하게 하고 자동 밝기 대비를 클릭하여 이미지의 품질을 자동으로 최적화합니다. 처리 후 이미지를 직렬 이미지 시퀀스로 저장하고 이미지 시퀀스를 적절한 3D 재구성 소프트웨어 프로그램으로 내보냅니다. 모든 다광현미경 이미지에서 EGFP tdTomato 및 SHG 신호를 각각 의사 그린, 레드 및 시안으로 제시한 후 스냅샷으로 3D 구조 이미지를 캡처합니다.
다광 현미경 검사는 이중 형광 형형 형질 전환 마우스의 각막 상피에서 피상적 날개와 기저 세포의 시각화를 허용합니다. 기저 층에서 단일 셀은 단일 육각형 모양의 피상 세포뿐만 아니라 피상층으로 매핑될 수 있다. tdTomato 신호의 세포질 발현에 의해 드러난 바와 같이, 골기 장치 및 내피성 망상을 포함한 세포 내 혈관 계통이 풍부한 막 단백질이 날개 세포 내에 흩어져 있다.
콜라주 기질 내, 스텔레이트 모양의 coratesites는 이 마우스에 있는 EGFP 형광을 표적으로 하는 막에 의해 설명됩니다. 대학 기질에 내장 된 coratesites는 내피 세포 내에서 보다 더 느슨하게 간격. 또한, 각막 스트로마 내의 얇은 분기 신경은 또한 tdTomato 신호를 표적으로 하는 멤브레인에 의해 시각화될 수 있고 각막 내피 세포 단층은 벌집 패턴에 연결된 비교적 균일한 육각형을 나타낸다.
림팔 상피는 상피 세포의 1 ~ 2 층으로 구성됩니다. 이중 형광 기자 형질 변형은 또한 결막 내의 모세 혈관의 이미징을 가능하게하여 혈관 내피를 설명하는 모세 혈관의 3D 아키텍처의 재구성을 용이하게합니다. 부상 없이 적당한 압력으로 안구를 안정화하는 것은 부족하거나 과도한 압력이 이미지 품질을 손상시킬 수 있기 때문에 양질의 이미지를 획득하는 데 중요합니다.
이 NVivo 화상 이미징 플랫폼은 안구 표면 아래 구조의 시각화를 위해 수정할 수 있으며 다양한 안과 질환의 내부 연구에 적용 될 수 있습니다.
